茶多酚對冷藏鱸魚鮮度變化及 肌原纖維蛋白氧化的影響

鞠 健,喬 宇,李冬生,廖 李,熊光權,汪 蘭

(1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所,湖北省農業科技創新中心農產品加工分中心,湖北武漢 430064； 2.湖北工業大學生物工程與食品學院,湖北武漢 430068； 3.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

鱸魚(Lateolabraxjaponicus),又名花鱸、鱸板、寨花等,是常見的經濟魚類之一,也是發展淡水養殖的主要品種,其肉質鮮美、營養豐富,富含蛋白質、維生素、鈣、鎂、鋅、硒等營養元素,具有補肝腎、益脾胃、化痰止咳之功效,因此深受各國消費者的喜愛[1]。然而,由于鱸魚肌肉中脂肪含量較高,因此極易產生氧化酸敗等問題,這不僅會使產品產生不愉快的酸敗味,而且還會使產品發生褪色、褐變等現象,從而使產品品質發生劣變,降低了產品的商業價值。因此,如何抑制鱸魚在運輸、貯藏、加工和銷售過程中的氧化酸敗,保證其產品品質和安全顯得尤為重要。

眾所周知,茶多酚(Tea polyphenols)是茶葉中主要的生物活性物質[2],無毒無異味,具有較強的抗氧化性,作為一種天然抗氧化劑,現為衛生部批準的食品添加劑。茶多酚作為天然抗氧化劑與其他天然抗氧化劑(如VC、VE、迷迭香提取物等)比較,具有獨特的高效抗氧化效果[3]。鑒于茶多酚的高效抗氧化效果及無毒無異味的特點,使其在食品保鮮中的應用受到了越來越多的關注。例如范凱等[4]研究了茶多酚結合輻照處理對冷藏鱸魚品質的影響;鞠健等[5]研究了茶多酚結合包裝對鱸魚在冷鏈物流過程中品質的影響;在此基礎上鞠健等[6]還研究了茶多酚結合氣調包裝對鱸魚品質的影響。目前,雖然關于茶多酚在鱸魚保鮮中的應用的研究已有部分相關報道,但他們均集中于對鱸魚冷藏品質的研究,而關于茶多酚對冷藏鱸魚肌原纖維蛋白氧化的研究卻鮮有報道。

本實驗以鱸魚為研究對象,將其在0.20%的茶多酚溶液中浸漬60 min后在4 ℃條件下貯藏,通過測定蛋白的相關氧化指標,研究茶多酚對鱸魚貯藏過程中肌原纖維蛋白的抗氧化效果,為從蛋白質氧化角度防止魚肉類制品在貯藏過程中品質下降提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活鱸魚 湖北省武漢市洪山區武商量販農科院店;硫酸、鹽酸、氯化鈉、乙醇、冰乙酸、氧化鎂、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、硼酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉等 均為分析純；溴甲酚綠、甲基紅、次甲基藍、Ca2+-ATPase酶試劑盒 連云港市鑫源化工股份有限公司;2-硫代巴比妥酸(生化試劑)、茶多酚(純度 90%)、無菌蒸煮袋(12 cm×17 cm) 國藥集團化學試劑有限公司。

UV-3802型分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司;SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;F93型熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司;GL-25MS型高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;FG2便攜式pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;BS-210型稱量天平 Sartorius Instruments Ltd.德國。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本處理 將鮮活鱸魚置于裝有水的白色泡沫箱中運回實驗室,即殺后,去頭和內臟,取背部兩邊肌肉切成大小約為4 cm×3 cm×2 cm的魚塊80塊,用無菌水清洗,將魚肉隨機分成2組,每組40塊。根據國家食品添加劑使用限量和相關文獻報道[7-9]并結合預實驗經驗,將茶多酚的濃度配制成0.2%(w/v)。對照組和茶多酚處理組分別用蒸餾水和0.2%(w/v)茶多酚溶液浸漬處理60 min,在4 ℃條件下瀝干后用無菌蒸煮袋包裝封口,置于4 ℃冰箱中貯藏,分別于第0、2、4、6、8、10 d測定各指標。

1.2.2 K值的測定 參照Choia等[10]方法。

K(%)=100×(HxR+Hx)/(ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx)

式中:HxR為次黃嘌呤核苷含量;Hx為次黃嘌呤含量;ATP為三磷酸腺苷含量;ADP為二磷酸腺苷含量;AMP為腺苷酸含量;IMP為肌苷酸含量;單位均為μmol/g。

1.2.3 揮發性鹽基總氮(TVB-N)值的測定 參照GB/T 5009.44-2003《肉與肉制品衛生標準的分析方法》[11]。

1.2.4 肌原纖維蛋白鹽溶性的測定 參照周茹等[12]的方法。釆用雙縮脲方法繪制蛋白濃度標準曲線:分別取6只試管,加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL牛血清蛋溶液(10 mg/mL),用蒸餾水定容至1 mL,然后分別加入4 mL雙縮脲試劑,于25 ℃下放置30 min,在540 nm下測吸光度。分別以吸光度和濃度為X和Y軸,建立回歸方程y=0.0543x+0.0176(R2=0.9997)。

1.2.5 Ca2+-ATPase酶活性的測定 使用Ca2+-ATPase酶試劑盒測定。

1.2.6 表面疏水性的測定 參照Benjakul 等[13]的方法進行。

1.2.7 總巰基和活性巰基含量的測定 參照孫麗[14]的方法進行。

1.3 數據分析

采用Origin 8.5進行作圖,SPSS 11.0統計軟件進行單因素方差分析,p<0.05為差異顯著,p<0.01為差異極顯著,實驗數據用X±S表示。

2 結果與分析

2.1 K值的變化

K值是用來評價魚等水產品新鮮程度的一項重要指標,它主要是通過魚肉等水產品中ATP含量的變化來表示。依據Saito等[15]報道當K值小于等于20%時,魚肉為一級新鮮度;大于20%小于等于50%時為二級新鮮度;高于50%時為不新鮮。K值的變化受到許多因素的影響,如魚的種類、捕魚的應激狀態和貯藏溫度等。由圖1可知,魚肉的初始K值為17.34%,這表明初始魚肉非常新鮮。盡管對照組和茶多酚處理組中的樣品的K值在整個貯藏期間逐漸增加,但茶多酚處理組中樣品的K值在4～10 d間顯著低于(p<0.05)對照組。到貯藏末期第10 d時,對照組中樣品的K值達到了50.37%,然而茶多酚處理組中樣品的K值為41.23%,由此可見,在貯藏末期第10 d時茶多酚處理組中樣品的K值顯著低于(p<0.05)對照組。這表明0.2%的茶多酚可以有效地抑制ATP的降解及相關產物的生成。Li等[16]報道,大黃魚在冷藏期間使用殼聚糖結合茶多酚處理可以有效抑制K值的增加,與空白對照組相比降低了19.31%。

圖1 鱸魚在冷藏過程中K值的變化Fig.1 Changes in K value of weever during chilled storage

2.2 TVB-N值的變化

TVB-N是動物性食品在貯藏期間,由于肌肉中的內源酶和微生物共同作用導致蛋白質分解而產生的三甲胺、二甲胺、氨和其他氮類化合物。由圖2可知,所有實驗組中TVB-N的含量隨著貯藏時間的延長均呈現出不斷增加的趨勢。整個貯藏期間茶多酚處理組中TVB-N的含量顯著低于(p<0.05)對照組,到貯藏結束第10 d時對照組和茶多酚處理組中TVB-N的含量分別為21.5 mg N/100 g和18.3 mg N/100 g。根據GB 2733-2015《鮮、凍動物性水產品衛生標準》的規定,魚肉的TVB-N值不得超過限量值20 mg/100 g,超出即為不可食用。這可能是因為茶多酚具有較好的抗氧化與抑菌作用,從而導致非蛋白化合物氧化脫氨基的速度減慢所致。鞠健等[17]報道,鱸魚在冷藏期間使用茶多酚結合Nisin處理可以有效抑制TVB-N值的增加,與空白對照組相比到貯藏末期第20 d時降低了53.63%。因此,茶多酚可以較好的抑制鱸魚在貯藏期間TVB-N的形成。

圖2 鱸魚在冷藏過程中揮發性鹽基氮變化Fig.2 Changes in TVB-N of weever during chilled storage

2.3 肌原纖維蛋白溶出量的變化

由圖3可以看出,在整個貯藏期間鱸魚肌原纖維蛋白的溶出量隨著貯藏時間的延長而不斷下降,這可能是因為氧化降低了蛋白的溶解性。對照組和茶多酚處理組中肌原纖維蛋白的溶出量從最初時的205 mg/g到貯藏結束第10 d時分別下降到了94.7、114.5 mg/g且第10 d的處理組比對照組高出20.91%。由此可見,茶多酚處理組中肌原纖維蛋白的溶出量顯著低于(p<0.05)對照組。肌原纖維蛋白的溶出量受多種因素的影響,Sompongsew等[18]認為巰基氧化形成二硫鍵也會導致肌球蛋白重鏈的聚集,從而降低其溶出量。在本研究中,肌原纖維蛋白的溶出量降低可能是因為在貯藏過程中,肌原纖維蛋白發生變性或降解所導致。汪金林等[19]在研究茶多酚對冷藏養殖大黃魚品質的影響時表明,茶多酚處理可以較好地抑制大黃魚肌肉在冷藏期間肌原纖維蛋白溶出量的下降。

圖3 鱸魚在冷藏過程中肌原纖維蛋白溶出量的變化Fig.3 Solubility changes of myofibril protein from weever muscle during chilled storage

2.4 Ca2+-ATPase活性的變化

肌球蛋白中的ATPase酶具有生理活性,能夠受到金屬離子的激活。當鈣離子存在時,ATPase酶被賦予活性,此時便稱為Ca2+-ATPase酶[20]。Ca2+-ATPase酶活的大小取決于肌球蛋白的變性程度。因此,該指標的大小能夠反映肌球蛋白變性程度[21]。Benjakul等[22]研究也表明,在低溫貯藏期間肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性是評價肌肉蛋白質變性的重要指標。如圖4所示,在整個貯藏期間,隨著貯藏時間的延長,魚肉肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性呈現快速下降的趨勢。對照組和茶多酚處理組中Ca2+-ATPase活性由最初時的1.29 U/mgprot到貯藏末期第10 d 時分別下降到了0.21、0.33 U/mgprot，且第10 d時處理組比對照組高出57.14%。由此可見,對照組中Ca2+-ATPase活性顯著(p<0.05)低于茶多酚處理組。這可能是因為茶多酚較強的抗氧化作用延緩了肌球蛋白的變性。

圖4 鱸魚在冷藏過程中Ca2+-ATPase活性的變化Fig.4 Changes in Ca2+-ATPase activity of myofibril protein from weever muscle during chilled storage

2.5 表面疏水性的變化

蛋白質的表面疏水性能夠反映蛋白質分子內部疏水基團的暴露程度[23]。疏水基團暴露越多,肌原纖維蛋白的表面疏水性越大,意味著它的變性程度也越大,所以可用它來反映蛋白質的變性程度。由圖5可知,在整個貯藏期間肌原纖維蛋白的表面疏水性均呈不斷升高的趨勢,到貯藏末期第10 d時茶多酚處理組中肌原纖維蛋白的表面疏水性顯著低于對照組(p<0.05),其值分別為207.3和177.9 S0ANS。這與 Morzel等[24]對骨骼肌的研究結果是一致的。這可能是因為在貯藏過程中蛋白質構像發生變化,一些疏水性的脂肪族與芳香族氨基酸側鏈基團從蛋白分子內部暴露出來,促進了蛋白折疊的發生,導致了疏水值的增加。Hill等[25]認為巰基的氧化也會導致蛋白質疏水性的增加,而茶多酚具有較強的抗氧化性,在冷藏期間能夠較好的抑制蛋白巰基的氧化,延緩蛋白質的變性速度。

圖5 鱸魚在冷藏過程中表面疏水性的變化Fig.5 Changes in surface hydrophobicity of myofibril protein from weever muscle during chilled storage

表1 各指標之間的相關性分析Table 1 The correlation analysis of the evaluation indexes

注:*p<0.05,**p<0.01。2.6 總巰基和活性巰基的變化

在蛋白質的功能基團中,巰基具有很強的反應活性,且對于維持蛋白質的結構和功能具有重要作用。在貯藏期間巰基氧化生成二硫鍵,導致巰基含量的下降。因此,巰基含量可以作為蛋白氧化的一個重要指標[26]。由圖6和圖7可知,總巰基和活性巰基的含量在整個貯藏期間呈不斷下降的趨勢,對照組和茶多酚處理組中總巰基的含量由最初時的0.151 mmol/g分別下降到貯藏末期第10 d時的0.038和0.045 mmol/g，且第10 d時處理組比對照組高出18.42%;活性巰基的含量由最初時的0.125 mmol/g分別下降到貯藏末期第10 d時的0.019和0.036 mmol/g，且第10 d時處理組比對照組高出89.47%。茶多酚處理組中總巰基和活性巰基的含量在整個貯藏期間均顯著低于(p<0.05)對照組。本研究中巰基含量下降的原因可能與肌原纖維蛋白空間內部結構的變化有關。在整個貯藏期間巰基氧化生成二硫鍵,導致肌原纖維蛋白的空間結構遭到破壞,疏基含量下降。巰基含量的減少與Ca2+-ATPase活性下降的趨勢一致,也驗證了此結論。

圖6 鱸魚在冷藏過程中總巰基含量的變化Fig.6 Changes in total sulfhydryl content of myofibril protein from weever muscle during chilled storage

2.7 蛋白氧化指標和新鮮度的相關性分析

將表征新鮮度的指標K值和TVB-N值與蛋白質氧化指標進行了皮爾遜相關分析(表1),結果發現表征新鮮度的指標K值和TVB值均與總巰基、活性巰基、肌原纖維蛋白溶出量呈極顯著負相關(p<0.01),K值和TVB值與表面疏水性呈極顯著正相關性(p<0.01),表明肌原纖維蛋白的氧化與鱸魚的新鮮度有很好的相關性,這種關聯性給予我們判別新鮮度很好的啟示,今后可以通過蛋白組學技術進一步鑒定氧化蛋白質,找到表征鱸魚新鮮度的指示蛋白。

3 結論

在4 ℃冷藏條件下,茶多酚處理可以較好的保持鱸魚在貯藏期間的鮮度和品質。能夠顯著地抑制鱸魚在貯藏期間K值、TVB-N值和表面疏水性的增加(p<0.05);在整個貯藏期間肌原纖維蛋白的溶出量、Ca2+-ATPase活性、巰基和活性巰基的含量均顯著高于(p<0.05)空白對照組。這表明茶多酚對冷藏鱸魚肌原纖維蛋白具有較好的保鮮效果。K值和TVB值均與總巰基、活性巰基、肌原纖維蛋白溶出量呈極顯著負相關(p<0.01),與表面疏水性呈極顯著正相關性(p<0.01)。

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