熒光標記免疫層析技術 在食品安全檢測中的應用研究進展

湯軼偉,張 宏,崔芷萌,焦雪晴,劉 歡,鐘克利,劉秀英,高子媛,徐志祥,丁浩宸,勵建榮,*

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121013;2.山東華盛天同標準技術服務有限公司,山東濟南 250102;3.山東農業大學食品科學與工程學院,山東泰安 271018;4.遼寧安井食品有限公司,遼寧臺安 114100)

食物是人類賴以生存和繁衍的物質基礎,食品安全問題關系到每個人的身體健康。隨著食品工業及全球貿易的發展,除了傳統的食品質量安全問題以外,由食品生產、加工新技術與新工藝帶來的新的危害日益突出,主要表現為食品污染及非法添加事件頻發、食源性疾病不斷上升、食品造假案件接連發生。食品安全快速檢測技術是食品安全保障的重要支撐，與食品安全儀器檢測技術相比,食品快速檢測技術具有檢測時間縮短,實驗準備、樣品制備、操作過程簡單等特點。

免疫層析技術(Immunochromatographic Assay,ICA)是20世紀末發展起來的結合免疫技術和色譜層析技術的一種分析方法,該方法具有特異性強、操作簡單、快速等特點,廣泛應用于臨床診斷、環境監測、食品安全等重要領域[1-2]。傳統免疫層析技術以膠體金為標記物,通過條帶顯色對目標物定性檢測或半定量分析。該方法雖然簡單快速,但靈敏度較差,難以準確定量[3-4]。熒光免疫層析技術作為一項新型免疫檢測技術,既保留了傳統膠體金試紙條的現場快速檢測優點,又加入了熒光檢測技術的高靈敏度特點,成為提高免疫層析方法檢測性能的主要途徑之一。本論文對熒光免疫層析技術原理、熒光標記物種類及熒光免疫層析技術在食品安全檢測中的應用進行綜述,并展望了未來發展趨勢。

1 熒光免疫層析技術

熒光免疫層析技術是基于抗原抗體特異性免疫反應的新型膜檢測技術。該技術以固定有檢測線(包被抗體或包被抗原)和質控線(抗抗體)的條狀纖維層析材料為固定相,測試液為流動相,熒光標記抗體或抗原固定于連接墊,通過毛細管作用使待分析物在層析條上移動。對于帶有多個抗原決定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等),通常采用“三明治”型雙抗夾心免疫層析方法,即待測物在流動相作用下先與熒光標記抗體結合,當到達檢測線時再與包被抗體結合形成雙抗夾心的“三明治”型(圖1A)。對于只具有單一抗原表位的小分子抗原(農、獸藥、違禁藥物等),待測小分子抗原與熒光標記抗體結合后,由于空間位阻作用難以再與檢測線上的包被抗體結合(圖1B)。所以,具有單一抗原表位的小分子待測物多采用競爭免疫層析法檢測。

圖1 熒光試紙條示意圖[5]Fig.1 Schematic diagram of fluorescence strip[5]注:A:“三明治”免疫層析試紙條;B:競爭免疫層析試紙條。

2 熒光標記物種類及熒光免疫層析技術應用

熒光免疫層析分析方法具有靈敏度高、穩定性好、受自然熒光本底干擾低等優點,成為食品質量安全快速檢測分析研究的熱點。目前,用于熒光免疫分析的標記物主要包括熒光素、量子點、上轉換納米粒子等。

2.1 熒光素免疫熒光層析技術

熒光素是指具有熒光特性的有機染料。1942年,Coons等首次報道了異氰酸熒光素標記抗體用于檢測鼠組織切片中肺炎球菌抗原分布的研究,由此出現了免疫熒光技術。后來,為了改進異氰酸熒光素的性能,Rigggs等合成了性質穩定、毒性較低的異硫氰酸熒光素。自Marshall等改良了熒光抗體標記技術后,熒光免疫技術得到快速發展。目前,應用于熒光免疫分析的熒光素主要有以下5種:異硫氰酸熒光素、四乙烯基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、與酶作用后產生熒光的物質和鑭系[6]。

宋春美等[7]采用異硫氰酸熒光素作為標記材料標記萊克多巴胺單克隆抗體,應用免疫層析技術研制萊克多巴胺熒光檢測試紙條,并對其靈敏度、特異性、重復性進行了測定。研究結果表明,該免疫層析試紙條的檢測限為1 μg/L,較同一抗體的膠體金試紙條的敏感性提高了10倍;與結構類似物交叉反應結果顯示該方法具有良好的特異性;以不同批次的檢測試紙對牛奶等樣品中萊克多巴胺殘留進行檢測,結果一致性較高,重現性良好。該檢測方法快速,能在10 min內顯示結果。

熒光材料在免疫層析技術中的應用顯著提高了該方法的檢測性能。然而,有機染料標記物光照下易分解,易發生光漂白現象,具有濃度淬滅特征,影響了分析結果的準確性和可靠性[8]。將熒光素包裹于聚苯乙烯微球是提高熒光素分析性能的有效方法,Majdinasab等[9]以聚苯乙烯/Eu3+納米粒子標記赭曲霉毒素A(OVA)抗體作為熒光探針,以赭曲霉毒素/牛血清白蛋白偶聯物和兔抗鼠抗抗體分別噴涂于纖維素膜上作為檢測線和質控線構建了熒光免疫層析檢測方法,最優條件下該方法對實際樣品的檢測限為1 μg/kg。Tang等[10]對比了聚苯乙烯包裹Eu3+配合物熒光微球與膠體金標記物在免疫層析分析中的穩定性,結果顯示：聚苯乙烯熒光微球具有較高的穩定性和靈敏度,更適合用于免疫層析分析。

2.2 量子點免疫層析技術

量子點(Quantum Dots,QDs)是一種半導體熒光納米顆粒,直徑通常在1～20 nm之間,一般由II-VI或III-V族元素組成[11-12]。與有機染料熒光標記材料相比,量子點具有斯托克斯位移大,激發光譜寬、發射光譜窄,熒光發射強度強而穩定,量子產率高,耐光漂白[13],成為分析檢測領域研究的新熱點。

白亞龍[14]以紅色CdTe量子點為代表,通過免疫層析法探討了量子點與小鼠lgG抗體的最佳偶聯方式,結果顯示以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合物(質量比3∶4)為偶聯劑制備的熒光探針性能優于直接偶聯和以DEC和NHS單獨作為偶聯劑偶聯得到的熒光探針;采用硅烷偶聯試劑APTES氨基化的二氧化硅納米粒子(50～500 nm)為載體,通過偶聯試劑EDC與NHS將其與CdTe量子點偶聯,制備得到了高強度的熒光微球;初步研究結果表明：熒光免疫層析方法的靈敏度比膠體金免疫層析體系高4～20倍。

Nardo等[15]將羧基化量子點通過活化酯方法與伏馬毒素(Fumonisins)抗體偶聯作為熒光標記探針,建立了玉米中伏馬毒素B1熒光免疫層析試紙檢測方法,測定過程如圖2所示。實驗結果顯示,該方法的檢測限為2.8 μg/L,實際樣品的檢測范圍為30～3500 μg/kg,檢測分析時間(包括樣品處理)為22 min。在相同檢測條件下,量子點熒光免疫層析試紙檢測方法的靈敏度高于膠體金試紙檢測方法，但是由于熒光信號需在試紙條干燥后才能穩定,所以用時相對較長。

圖2 量子點免疫層析吸附測定過程示意圖[15] Fig.2 Schematic description of QD-based immunochromatographic strip test in dipstick format[15]

胡華軍等[16]采用巰基丁二酸修飾CdTe/ZnSe核殼量子點,在N-羥基琥珀酰亞胺作用下與抗克倫特羅多克隆抗體偶聯,通過凝膠電泳和斑點雜交實驗驗證了量子點與抗體的偶聯效果。將合成的量子點與抗體的偶聯物為熒光探針制備了用于檢測克倫特羅的免疫層析試紙條,其靈敏度為1 ng/mL,通過ELISA方法驗證表明：該試紙條可用于實際樣品中克倫特羅殘留的快速測定。

周耀鋒等[17]采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺法將抗赭曲霉毒素A腹水與CdTe/ZnSe量子點偶聯作為熒光探針,以牛血清白蛋白-赭曲霉毒素偶聯物及驢抗鼠二抗噴涂于硝酸纖維素膜上形成檢測線和質控線,并建立了基于檢測線/質控線熒光強度比值的免疫層析試紙條高靈敏度、快速定量檢測玉米中赭曲霉毒素的方法。研究結果表明,該量子點熒光試紙條定量檢測赭曲霉毒素的線性范圍為0.05～1.0 ng/mL,玉米提取液中赭曲霉毒素的檢出限為0.05 ng/mL,單個樣品的檢測時間為10 min。40個實際玉米樣品檢測結果表明,量子點熒光微球試紙條與ELISA檢測赭曲霉毒素的結果具有良好的相關性。

Sun等[18]通過碳二亞胺法將微囊藻毒素抗體與水溶性的CdTe量子點偶聯作為探針,建立了檢測微囊藻毒素的熒光免疫層析快速檢測方法。最優條件下,該檢測方法的線性范圍為:25～5 μg/L(R2=0.9901),測定限為0.1 μg/L,重現性好,變異系數為10%,可實際檢測水環境中微囊藻毒素含量測定。

Yu等[19]以CdTe/CdS量子點與EscherichiacoliO157∶H7抗體偶聯噴涂于玻璃纖維結合墊,以EscherichiacoliO157∶H7抗體和羊抗兔抗抗體噴涂于硝酸纖維素膜上作為檢測線和質控線構建熒光免疫層析試紙條及檢測方法。最優條件下,該方法的檢測限位104CFU/mL,與其它Escherichiacoli株系無交叉反應。該試紙條可在室溫避免條件下保存35 d,檢測方法快速(小于12 min)、靈敏,可定量檢測食品樣品中的細菌含量。

為了提高熒光免疫層析試紙條的檢測通量,提高測定結果的準確性,Taranova等[20]將氯霉素抗體、鏈霉素抗體、氧氟沙星抗體分別與具有不同發射波長的量子點偶聯,并以此為熒光探針構建了可同時檢測牛奶中三種抗生素的熒光免疫層析試紙條,建立了不同抗生素濃度與熒光強度之間的線性關系,實際樣品檢測結果如圖3所示。研究結果表明,最優條件下該試紙條對氧氟沙星的檢測限為0.3 ng/mL,氯霉素的檢測限為0.12 ng/mL,鏈霉素的檢測限為0.2 ng/mL,比使用同一對應抗體建立ELISA方法的檢測限低80～200倍,對實際牛奶樣品的添加回收率為92%～101%。

圖3 檢測3種抗生素類藥物量子 點熒光免疫層析試紙檢測結果[20]Fig.3 Immunochromatographic test for testing samples in the absence of analytes(control experiment)[20]注:a:不含有任何藥物,b:含有氧氟沙星(200 ng/mL),c:含有氯霉素(10 ng/mL),d:含有鏈霉素(500 ng/mL)。

Wang研究團隊采用微乳液技術將量子點CdSe/ZnS包裹起來形成量子點微球,然后將該微球與玉米烯酮及黃曲霉毒素B1抗體偶聯作為競爭性熒光探針。與上述免疫層析試紙不同,該熒光探針不噴涂于試紙條上,而是在應用時將其與樣品提取液混合后滴于樣品墊,在層析作用下與硝酸纖維素膜上噴涂的包被抗原(檢測線)及羊抗鼠抗抗體(質控線)競爭結合。研究結果表明,制備的量子點微球比相對應量子點的熒光強度可增強千倍以上,而且檢測靈敏度得到顯著提高[21-22]。綜合比較熒光微球與量子點熒光免疫層析檢測方法,熒光微球免疫層析檢測方法的檢測限更低,準確度、精確度、重現性更好[23]。

石墨烯(Graphene)是一種由碳原子以sp2雜化方式形成的蜂窩狀準二維材料。氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)是石墨烯的氧化物,在水中具有優越的分散性,可通過熒光共振能力轉移方式使熒光物質發生熒光淬滅。Morales-Narváez等[24]利用氧化石墨烯可淬滅熒光的特性用于熒光免疫層析檢測中，作為病原菌顯示劑,該研究將量子點CdSe@ZnS與抗體偶聯物(Ab-QDs)及量子點CdSe@ZnS分別噴涂于試紙的檢測線和質控線。檢測時若測試液中含有目標物,則目標物與檢測線上的抗體結合,阻止氧化石墨烯淬滅檢測線上量子點發出的熒光;若測試液中沒有目標物,則氧化石墨烯淬滅檢測線上量子點產生的熒光。該實驗中質控線上量子點產生的熒光不論測試液中是否含有目標物都被氧化石墨烯淬滅。檢測示意圖如圖4所示。研究結果表明,該方法具有較高的特異性和靈敏度,對瓶裝水及牛奶樣品中大腸桿菌的檢測限為100 CFU/mL。

圖4 以氧化石墨烯為病原菌顯示劑的 熒光免疫層析病原菌檢測示意圖[24]Fig.4 Photoluminescent lateral flow test revealed by grapheme oxide(GO)for pathogen detection[24]

2.3 上轉換納米粒子免疫層析技術

上轉換發光是指反-斯托克斯發光,即用低能量的紅外或近紅外光激發，從而發射出高能量的紫外或可見光[25]。上轉換發光大都發生在摻雜稀土離子的化合物中,NaYF4是目前上轉換發光效率最高的基質材料。與熒光染料、量子點相比,上轉換納米粒子毒性低、靈敏度高、穩定性好,可避免由于樣品中具有熒光特性基質對檢測結果的影響,是目前理想的熒光標記物之一[26]。

Wang等[27]將抗克倫特羅抗體與醛基修飾的上轉換納米粒子偶聯作為熒光探針噴涂于連接墊,以克倫特羅-牛血清白蛋白偶聯物和抗抗體分別包被于硝酸纖維素膜上，作為檢測線和質控線構建上轉換熒光免疫層析試紙,圖5為不同克倫特羅濃度質控線和檢測線上轉換熒光強度變化。研究結果表明,最優條件下該熒光免疫層析試紙的目視檢測限和計算檢測限均為0.1 ng/mL,檢測時間為10 min,樣品的添加回收率為73.0%～92.2%。以上轉化納米粒子作為免疫層析技術中的熒光標記物可簡化實施現有的樣品前處理方法,這是因為樣品基質或其它具有熒光性質的干擾物在紅外或近紅外光激發下不產生發射光譜,對檢測結果影響較小。

圖5 不同克倫特羅濃度質控線 和檢測線上轉換熒光強度變化[27]Fig.5 The upconversion fluorescence intensity of control line and test line in the presence of varying concentrations of clenbuterol[27]

王瑜等[28]將氨基修飾的NaYF4:Yb,Er上轉換納米粒子與己烯雌酚單克隆抗體偶聯為免疫層析熒光探針,分別以噴涂于硝酸纖維素膜上的己烯雌酚-牛血清白蛋白偶聯物和羊抗鼠抗抗體為檢測線和質控線,建立了上轉換免疫層析熒光快速定量檢測己烯雌酚殘留方法。實驗結果表明,該試紙條線性范圍為25～1000 ng/mL,檢出限為20.84 ng/mL,單個樣品檢測時間為15 min,批內批間變異系數小于10%,牛奶樣品的添加回收率為90.1%～115.2%,相對標準偏差小于5%,為牛奶中己烯雌酚殘留快速定量檢測提供了新的測定方法。

王浩然等[29]基于上轉換免疫熒光單靶標檢測試紙,成功研制出對乙型副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌O1和O139群、大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等10種食源性致病菌具有現場檢測能力的十通道試紙盤檢測系統,可滿足食品樣品增菌檢測和腹瀉樣本直接檢測的靈敏度要求。劉曉等[30]以上轉換發光材料為標記物,建立了可對奶制品中黃曲霉毒素M1進行現場快速檢測的上轉換熒光免疫層析快速定量檢測方法。最優條件下,該方法對奶粉和牛奶中黃曲霉毒素M1的檢測靈敏度分別達到0.1 ng/mL和0.3 ng/mL,每個濃度重復測量的變異系數小于15%。該研究構建的上轉換熒光免疫層析試紙條檢測方法操作簡便快捷、樣品前處理簡單、具有良好的檢測敏感性和特異性,對實際樣品的耐受性較好,可滿足食品安全中對現場快速檢測的需求。

Liu等[31]以核殼型NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4納米顆粒與頭孢氨芐抗體偶聯，作為熒光探針噴涂于結合墊,以頭孢氨芐-牛血清白蛋白偶聯物和羊抗鼠抗抗體分別噴涂于硝酸纖維素膜上，作為檢測線和質控線。最優條件下,建立的上轉換熒光免疫層析方法的目測檢測線為10 ng/mL,定量檢測的線性范圍為0.5～100 ng/mL。

Zhao等[32]通過水熱反應法合成了羧基修飾的β-NaYF4:Yb,Er納米顆粒,在EDC和NHS作用與抗體偶聯作為熒光探針。最優條件下,建立的鰻弧菌MVM425上轉換熒光免疫層析檢測方法的線性范圍為103～109CFU/mL,相關系數為0.994,檢測限位102CFU/mL,比已報到的酶聯免疫檢測方法低100倍。

3 展望

免疫層析技術具有特異性強、靈敏度高、簡便快速、無需特殊昂貴儀器等優點,但傳統以膠體金標記的免疫層析檢測方法靈敏度低、難以定量的問題已限制了該方法的應用。熒光免疫層析技術的發展在一定程度上解決了傳統膠體金標記免疫層析出現的問題,迅速成為食品安全快速定量檢測領域研究的熱點。

熒光染料、量子點、上轉換納米粒子熒光標記免疫層析技術的發展及其在食品安全檢測中的應用，為我國的食品安全提供了新的技術支撐。為了熒光免疫層析技術在食品安全快速檢測領域更好的應用,該技術可在以下方面拓展深入研究:核酸適配體是一種具有特異分子識別性能的新型分子識別元件,比生物抗體合成更容易,穩定性更好,研究核酸適配體等新型分子識別元件在熒光免疫層析中應用具有重要意義;多殘留廣譜熒光免疫層析技術仍需深入研究;研制小型、便攜式、性能優良的熒光免疫層析試紙配套檢測儀器,提高熒光免疫層析定量檢測方法的準確度和靈敏度,促進儀器檢測方法的應用簡便性,降低檢測成本;研發提高抗體-熒光標記物探針抗干擾試劑,降低假陽性或假陰性現象的發生;建立簡單、快速、高效的樣品前處理方法,為食品安全現場快速定量檢測奠定基礎。

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