核酸適配體在海洋微生物 及海洋生物毒素識別鑒定中的應用研究進展

張慶慶,劉慧敏,吳仁協,鄢慶枇,曹 博,趙 銓,鄭 江,*

(1.鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心,集美大學水產學院,福建廈門 361021;2.廣東海洋大學水產學院,廣東湛江 524088)

隨著經濟社會的發展和海產品養殖規模的擴張,我國越來越多地區的海產品中檢測到海洋微生物和海洋生物毒素的存在[1-6]。海洋微生物和海洋生物毒素對海產品大范圍的污染不但影響了海產品的質量,還使人們的生命健康受到威脅,同時也制約了海產品養殖業的健康發展。眾所周知,海洋中存在數量眾多的海洋微生物和一些具有特殊結構的海洋生物毒素。海洋微生物是海產品中的主要污染物之一,使海洋經濟動物患病并造成巨大的經濟損失,還殘留在海產品中引起食用者不同程度的中毒反應,導致較大范圍的公共衛生問題。而另外一種危害較大的污染物是海洋生物毒素,它主要由某些藻類和貝類產生,一般擁有較強的神經毒性,可致人死亡。由于赤潮的頻發,使得這些毒素得以擴散并經由食物鏈進入魚蝦體內,造成多地多種海產品污染,最終危害人體健康[7]。因此,必須開展海洋微生物和海洋生物毒素的識別鑒定研究,這對維護海產品質量和食用安全具有積極意義。

近年來,針對海洋微生物和海洋生物毒素檢測的研究不斷深入并開發出一系列的檢測技術,例如免疫診斷技術等。其中,核酸適配體是近些年來新興的一種檢測手段,它在海洋方面的應用才剛剛起步。核酸適配體是利用指數富集配體的系統進化技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment),即SELEX技術,從人工構建的寡核苷酸文庫中篩選得到的一類對靶目標有高度親和力和嚴格特異性的寡核苷酸分子。最早的核酸適配體是Robertson在1990年發現的對ATP具有高度親和特異性的RNA片段[8],后來Tuerk等在此基礎上建立了核酸適配體的體外篩選技術,并篩選出了T4噬菌體DNA聚合酶的適配體[9]。此后,核酸適配體在生物醫學、藥物篩選、分子檢測等多個方面都得到了廣泛的應用和發展,并與熒光標記技術[10]、放射性標記技術[11]、納米技術[12]和微流體[13]等技術結合,在腫瘤細胞的檢測、抗腫瘤藥物的篩選以及靶向藥物的研發方面,取得了較好的發展。

由于核酸適配體對靶目標具有較高的親和特異性,使其在海洋微生物和生物毒素的識別鑒定中體現出較好的應用前景。本文主要從核酸適配體的應用角度,綜述其在海洋微生物和海洋生物毒素中的應用研究進展,為核酸適配體的應用及海洋微生物和生物毒素的研究提供參考。

1 核酸適配體簡述

核酸適配體的篩選是通過SELEX技術來實現的。SELEX技術篩選的基本原理是:首先體外合成一個單鏈隨機寡核苷酸文庫,將該文庫與靶物質混合,形成靶物質-寡核苷酸復合物,然后洗去未與靶物質結合或結合較弱的寡核苷酸,剩余的則是與靶物質結合較強、親和力較高的寡核苷酸分子,這些分子可通過加熱變性等方法分離出,然后再以分離出的這些親和力較高的寡核苷酸分子為模板進行PCR擴增,擴增出的寡核苷酸分子則作為新的寡核苷酸文庫進入下一輪SELEX篩選。不斷重復上述的篩選與擴增過程,使得一些與靶物質不結合或親和力較低的寡核苷酸分子被逐漸淘汰,最終獲得與靶目標有較高親和力的寡核苷酸文庫,即核酸適配體文庫。隨機寡核苷酸文庫包括DNA文庫和RNA文庫,文庫的中間通常為隨機序列,兩端則是固定序列,此固定序列是PCR反應及其他酶學反應相關引物的結合位點,可用于PCR反應或進行酶切作用。因此,核酸適配體的SELEX篩選的基本流程可歸納為如下幾個步驟(如圖1):靶物質與寡核苷酸文庫結合,形成相應的復合物;洗脫;PCR擴增。經過多次重復的篩選、洗脫與擴增,與靶物質有高親和力的寡核苷酸分子將在文庫中得到富集,高親和的核酸適配體的比例隨SELEX篩選次數的增加而增加,最后達到篩選要求。

圖1 SELEX技術流程圖Fig.1 Flow diagram of SELEX technology

與抗體蛋白相比,核酸適配體具有多種優勢。首先,核酸適配體更易于篩選、合成和修飾,在體外合成的同時,還可以修飾或連上一些功能基團或分子,如熒光素[14]、氨基[15]、納米顆粒[16]和藥物[17]等,而其功能和化學特性并不發生大的變化;其次,核酸適配體的特異性和親和力比抗體蛋白更強更高,靶標物質的范圍更廣,而且核酸適配體無免疫原性,可以進入到細胞或腫瘤的內部,實現對病變部位的定位[18-19];另外,核酸適配體還能作為靶向運輸的載體進行藥物定向運輸,而不會被當做外來抗原引起機體的免疫反應[20-23]。這些優勢讓核酸適配體在海洋微生物、生物毒素方面呈現出廣闊的應用前景。

2 在海洋微生物中的應用

目前,針對細菌、病毒等海洋微生物的主要檢測方法有生理生化方法、基于抗原抗體的免疫學方法和以核酸為靶分子的生物學檢測方法等[24-26],而這些方法都存在各自的不足。例如,生理生化鑒定法雖然是經典的細菌鑒定方法,但是它耗時、測試項目較多,難以滿足快速檢測的要求;16S rDNA[27-28]等以核酸為靶目標的檢測方法,對于同屬細菌的檢測區分效果并不理想,一方面是因為同屬細菌的種間基因同源性很高,不容易區分,另一方面是由于檢測擴增過程中,錯配而引發的假陽性和非特異性結果時有發生[29],這些都嚴重干擾了檢測的準確性;此外,以抗體為基礎的免疫診斷技術,則由于嚴格的抗體制備條件、較長的制備時間、以及抗體的穩定性差、難以修飾等缺點,嚴重制約了其在微生物檢測領域的應用。核酸適配體由于具有制備簡單、特異性強、應用廣等眾多優點,在微生物和腫瘤細胞的檢測方面呈現出較好的應用前景,但在海洋微生物方面的研究報道尚不多見,表1匯總了目前已篩選出的一些海洋微生物的核酸適配體及其功能參數。

表1 已報道海洋微生物核酸適配體匯總Table 1 Summary of reported marine microorganisms aptamers

注：-:文獻中未報道。

2.1 在海洋病毒中的應用

隨著海水養殖規模的不斷擴大,越來越多的海洋經濟動物被海洋病毒感染,給水產養殖業造成了巨大的損失,引起了人們對它的高度關注。核酸適配體在海洋病毒中的應用并不多,主要集中在虹彩病毒、神經壞死病毒等少數幾個病毒。

虹彩病毒是一種20面體狀、細胞質型DNA病毒,主要感染石斑魚等許多重要的海洋和淡水經濟魚類,對中國和東南亞地區的水產養殖業帶來巨大危害。Li[30]等利用Cell-SELEX技術篩選了被新加坡石斑魚虹彩病毒感染的石斑魚脾細胞的適配體,并以此為基礎構建了一種基于適配體的酶聯適配體吸附方法(ELASA)，用于被感染細胞的檢測。該方法是將傳統的酶聯免疫吸附方法中的抗體替換為適配體,在細胞內外都能特異性地檢測到虹彩病毒的感染,而且該方法只能識別被虹彩病毒感染的細胞,對被其他病毒感染或未感染的細胞沒有親和性,在檢測的速度、穩定性和親和特異性方面都超過了原有的酶聯免疫吸附方法,全程檢測時間僅需1～2 h。上述適配體不但對新加坡石斑魚虹彩病毒感染的細胞具有很高的親和特異性,而且研究發現它們還可以在細胞外抑制新加坡石斑魚虹彩病毒對魚細胞的感染,而對肝、脾細胞和宿主的其他組織等沒有細胞毒性作用,并能被被感染的魚細胞有效地內化,定位虹彩病毒在魚細胞內的組裝位點[31-32]。

此外,針對神經壞死病毒[33]、甲魚虹彩病毒[34]、牙鲆彈狀病毒[35]和病毒性出血性敗血癥病毒[36]的適配體也已被篩選出來,這些適配體不但對各自靶目標具有很好的親和特異性,它們還能夠顯著抑制病毒對宿主的感染,而對宿主則沒有細胞毒性作用。這些研究均表明：核酸適配體不但為海洋病毒的檢測提供了新的方法和策略,還能對原有的相關技術進行提升并擴大其應用的范圍,反映出核酸適配體在海洋病毒的檢測中具有較好的應用前景,這也為研究海洋病毒致病機制、疾病治療和藥物研發提供新的思路。另外,由于適配體還能夠進入被病毒感染的細胞,在靶向治療方面也呈現出較好的應用前景。不過,目前獲得的海洋病毒方面的適配體還較少,仍然需要大量的適配體篩選工作。

2.2 在海洋細菌中的應用

核酸適配體在海洋細菌中的應用研究主要集中于副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌等病原微生物。有研究表明,采用流式細胞儀、利用量子點修飾的適配體可以特異性地檢測副溶血性弧菌,相應的親和常數為16.88 nmol/L,并認為量子點的熒光壽命長、穩定性好,可以對標記的物體進行長時間的觀察,比單獨使用染料標記的探針靈敏度更高,能大大地增強其實用性和穩定性[37-38]。Duan[39]等開發出基于表面增強拉曼的適配體傳感器,一個適配體固定在納米顆粒表面用于捕獲副溶血弧菌,另一個適配體則通過與副溶血弧菌的結合報告該弧菌的存在,該傳感器在副溶血弧菌方面表現出很好的穩定性和親和性,并在10～106CFU/mL范圍內能實現對副溶血弧菌的定量檢測,檢測限為10 CFU/mL,這為其他相關研究奠定了較好的基礎。一些研究則采用辣根過氧化物酶標記技術,對溶藻弧菌及其滅活菌的核酸適配體進行了篩選,獲得了親和常數為10～50 nmol/L的一系列核酸適配體[40],其對溶藻弧菌的檢測限可達到10～103cells/mL[41-42],使得檢測限更低并大大簡化了檢測過程,節省了時間。有關哈維氏弧菌的核酸適配體目前也已篩選出,其親和常數在10～50 nmol/L的范圍,并能在混合菌中較好的識別哈維氏弧菌[43],這為哈維氏弧菌的檢測奠定了較好的基礎。另外,有些適配體還能同時識別哈維氏弧菌和溶藻弧菌[44],其親和常數在10～40 nmol/L的范圍,該適配體對哈維氏弧菌和溶藻弧菌都表現出了較好的親和特異性。此外,有關嗜水氣單胞菌的核酸適配體也已篩選出來,但是關于該適配體的親和常數和親和特異性方面的研究尚未見進一步的報道[45]。綜上所述,核酸適配體的出現為海洋細菌的檢測研究開辟了新的思路,彌補了原有檢測技術的一些缺陷,它與流式細胞儀、PCR等技術結合,使其靈敏度、穩定性和準確性都大為提高,反映出核酸適配體比抗體、基因等分子具有更好的應用性。

3 在海洋生物毒素中的應用

海洋生物毒素目前主要的檢測方法有液相色譜法、基于細胞的傳感器技術和酶聯免疫檢測技術等。雖然這些技術有著靈敏度高和可靠性好等優點,但是由于檢測過程需要復雜的預處理、專業的操作和大量的時間,無法滿足現場快速檢測的需要[46]。核酸適配體則在這方面有一定優勢,目前在海洋生物毒素方面的應用主要體現在河豚毒素、貝毒和藻類毒素等毒素的檢測方面。

目前已篩選出了河豚毒素的核酸適配體,建立了相應的適配體-熒光染料檢測方法,對河豚毒素的檢出限可達到10-6mo1/L,并通過比較適配體不同區域對河豚毒素的不同親和力,確定了相應適配體的核心識別區域[47-49],相關方法具有操作簡便快速、成本低廉、靈敏度高等優點。在貝類毒素方面,Handy[50]等利用石房蛤毒素-蛋白結合物實現了對石房蛤毒素適配體的篩選,提供了一種針對低分子量毒素的篩選策略,增加了適配體對低分子量毒素的多樣性和兼容性;Zheng[51]等在Handy等的基礎上對原適配體進行了基因定點誘變和敲除等改造,得到了一個新的適配體,該新適配體對石房蛤毒素的親和力更高,是原適配體親和力的30倍,親和常數達到133 nmol/L。在藻類毒素方面,目前已篩選出了雙鞭甲藻神經毒素-2的核酸適配體,并利用該適配體開發出了相應的電化學傳感器,其對雙鞭甲藻神經毒素-2的檢測限為106pg/mL,而對它的同系物雙鞭甲藻神經毒素-3不發生交叉反應[52]。另外,膝鉤藻毒素的核酸適配體目前也已篩選出來,該適配體能特異性地識別膝鉤藻毒素,而對它的同源物不發生識別反應[53]。

核酸適配體作為一種新型的海洋生物毒素檢測手段在靈敏度方面不如基于液相色譜的檢測技術,但是核酸適配體較液相色譜等其他檢測技術操作簡單、快速、且成本更低,不需要對被測毒素進行復雜的預處理,更不需要昂貴的儀器和專業的操作,其靈敏度完全能滿足日常檢測的需求,實際應用可行性更高。但總的來說,目前核酸適配體在海洋生物毒素方面的研究報道還不多見。

4 前景

核酸適配體在海洋微生物和海洋生物毒素領域的研究雖然剛剛起步,但一些對靶目標具有較高親和力和特異性的的核酸適配體已被篩選出來,一些基于核酸適配體的高靈敏的檢測技術也已得到研究和應用,與傳統的檢測手段相比,基于核酸適配體的檢測技術不但使過程簡化,也大大提高了檢測的靈敏度和準確性,在實用應用中體現了較好的開發前景。

當然,由于海洋環境中的微生物和毒素的種類眾多、結構復雜,未來還有很多工作需要進一步開展。首先,還需要進行更大范圍的篩選,要有更多的海洋微生物和生物毒素的核酸適配體被篩選出來,這是進一步研究開發的基礎。其次,急需開展核酸適配體在定量檢測中的應用研究。目前基于核酸適配體的應用檢測基本還是以定性檢測為主,由于海洋環境復雜,很難得到單一培養物,因此研發穩定、準確的基于核酸適配體的定量檢測技術就顯得極為必要。另外,利用核酸適配體對相應海洋微生物和生物毒素獨有的親和特異性,開發出一些能抑制靶目標生物活性的適配體藥物或靶向載體[54-56],這對于核酸適配體的應用研發也將具有積極意義。

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