諾如病毒檢測技術研究

潘衛兵+許韡

摘 要：諾如病毒是非細菌性腹瀉暴發的主要病原之一，對相關檢測技術的研究十分必要。本文通過引物、探針、染料的選擇，結合適用范圍、靈敏度、特異性、重復性的評估對常規反轉錄-聚合酶鏈反應、熒光定量RT-PCR、反轉錄-環介導等溫擴增、基因芯片、酶聯免疫吸附測定和熒光微球檢測條快速檢測諾如病毒的技術進行了綜述。著重關注了食品和水中諾如病毒檢測的病毒富集技術，并提出平衡準確靈敏與簡便高效對諾如病毒檢測技術的研究具有重要意義。

關鍵詞：諾如病毒；聚合酶鏈反應；熒光定量；反轉錄；RT-PCR；RT-LAMP

中圖分類號：R373.2+5 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.02.18

文章編號：1006-1959（2018）02-0051-03

Abstract：Norovirus is one of the main pathogens in non bacterial diarrhea，research on correlation detection technology is very necessary.This paper probes，primers，dye selection，combined with the applicable scope，sensitivity，specificity，repeatability of the evaluation of conventional reverse transcription polymerase chain reaction，fluorescence quantitative reverse transcription loop mediated RT-PCR.Mediated isothermal amplification，gene chip，ELISA and fluorescent microsphere detection strip for rapid detection of norovirus technology are reviewed.Focusing on the technology of virus detection in food and water enrichment of norovirus，and put forward the balance is accurate and sensitive and efficient research on the detection of norovirus has important significance.

Key words：Norovirus；Polymerase chain reaction；Fluorescence quantitation；Reverse transcription；RT-PCR；RT-LAMP

諾如病毒（norovirus）引起的急性腸胃炎在我國成上升趨勢，尤其在學校、幼兒園、養老院等低抵抗力人群聚集地易引起集體暴發。諾如病毒傳染性很強，可經糞-口傳播、人傳人、可經受病毒污染的水、食品等傳播。據估計，由諾如病毒造成的非細菌性腹瀉暴發占總數的50%～80%左右[1]。近年來，諾如病毒檢測方法的相關研究快速發展，對諾如病毒的準確檢測為其流行病學分析提供了依據，是有效防控該病毒的基礎。

1 病毒分型

諾如病毒依據其基因RNA聚合酶和主要衣殼蛋白VP1的核苷酸序列的同源性，可分為5個基因組：GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GⅤ，其中易感染人的主要是GⅠ和GⅡ基因組，國內尤以 GⅡ為多。而基于VP1基因組序列的相似性以>85%為界，可進一步將基因組分為不同的基因型：GⅠ-8個型，GⅡ-21個型，GⅢ-3個型，GⅣ-2個型，GⅤ-1個型[2]。

2 檢測技術的研究進展

目前諾如病毒的檢測技術主要有反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）、熒光定量RT-PCR、反轉錄-環介導等溫擴增（RT-LAMP）、基因芯片、酶聯免疫吸附測定（ELISA）和熒光微球檢測條快速檢測。

2.1 常規反轉錄-聚合酶鏈反應 反轉錄RT技術是將RNA為模板，以反轉錄酶催化，用引物合成互補DNA，再經PCR采用特異性引物擴增[3]，是定性檢測諾如病毒的經典技術。

王作虪等[4]用RT-PCR對131份腹瀉兒童的糞便標準進行檢測，使用兩對引物：① JV12：5'ATACCACTATGATGCAGATTA 3'/SM31：5'CGATTTCATCATCACCATA 3'，擴增目標長度為432bp；②4581： 5'TCTTCTCCTTCTATGGTGATGATGA3'/5102：5'CTTAGACGCCATCTTCATTTACG 3'，擴增目標長度為522bp，通過振蕩離心過濾后從糞便標本中提取出病毒RNA，經引物反轉錄后PCR擴增，1.5%瓊脂糖凝膠檢測特異性片段，結果131份糞便標本中檢出諾如病毒陽性22份，陽性標本經和已知核苷酸序列比對鑒定出22份標準均為GⅡ4型。

2.2熒光定量RT-PCR 實時熒光定量RT-PCR技術是在RT-PCR技術的基礎上利用染料或探針監測PCR反應管中的熒光信號從而達到定量的目的，目前實時熒光定量RT-PCR已逐漸替代常規RT-PCR成為應用最為廣泛的定量定性檢測諾如病毒的技術。

陳傳德等[5]選擇了兩種不同型號的熒光定量PCR儀，分別制作絕對定量標準曲線，以OG 1F/COG 1R、COG 2F/COG 2R為引物，以Taqman探針監測熒光信號，建立了有良好靈敏度、重復性的熒光定量RT-PCR快速檢測諾如病毒的技術，并通過試驗了輪狀病毒、腺病毒、星狀病毒、腸道病毒等易引起干擾的病毒，得出該方法具有良好的特異性。劉巍等[6]比較了熒光定量RT-PCR、常規RT-PCR、酶聯免疫法ELISA，對34個糞便樣本陽性檢出率分別為85.3%、76.5%、26.5%，可見熒光定量RT-PCR技術對諾如病毒的檢測靈敏度較高。王毅謙等[7]用雙重熒光RT-PCR的方法檢測GⅠ和GⅡ型諾如病毒，該研究使用allglo探針，對GⅠ和GⅡ型諾如病毒的檢出限為10copies/μl，比Taqman探針法和單重熒光RT-PCR法更加靈敏，該研究設計的引物和allglo探針，標記不同的熒光報告集團MAR和JUP，可于同一反應管內同時檢測GⅠ和GⅡ型諾如病毒，提高了檢測效率。莫雪梅等[8]用SYBR GreenⅠ熒光染料RT-PCR法檢測了貝類中的GⅡ型諾如病毒，檢測下限為100copies，檢測的穩定性較好，研究證明SYBR GreenⅠ熒光染料的濃度是影響結果的關鍵因素，濃度過低造成熒光強度小靈敏度不夠，濃度過高會抑制PCR反應，SYBR GreenⅠ熒光染料的終濃度為1×是合適的，此外該研究還將退火溫度提高到52 ℃以消減引物二聚體引起的干擾，達到了良好的效果。endprint

2.3病毒的富集 在檢測食品與水中諾如病毒時，由于病毒含量小，此時病毒的富集成為了最關鍵的環節，如膜過濾法和有機絮凝沉淀法[9]等富集手段。在采樣后，食品樣品的處理主要有兩個步驟：先對樣本基質上諾如病毒的洗脫和濃縮，然后提取諾如病毒的核酸，其中由以從樣本基質上洗脫和濃縮諾如病毒最為關鍵[10]。鄧麗麗等[11]在用熒光定量RT-PCR技術檢測牡蠣中諾如病毒時，著重摸索前處理方法，即病毒的富集，他們通過化甘氨酸緩沖液處理牡蠣勻漿液，摸索聚乙二醇（PEG）沉淀濃縮病毒的濃度，得到甘氨酸緩沖液pH值為4.5，PEG沉淀濃度為16%時的諾如病毒富集提取效果最好。周曉紅等[12]評估了用混合硝酸纖維素膜（MCE）和PEG沉淀共二次富集的方法檢測水中諾如病毒的方法，證明該方法將水樣濃縮了1000倍，大大提高了靈敏度，可用于水體中諾如病毒的檢測。李楠等[13]比較了磁珠富集法和PEG沉淀法檢測草莓中GⅡ型諾如病毒的適用性，結果顯示磁珠富集法的回收率略高于PEG沉淀法的回收率，而且兩種方法的回收率結果均能滿足檢測要求，均適用于檢測草莓中的GⅡ型諾如病毒，該研究也給其他的食品類樣本的病毒富集提供了一定的參考。張其剛等[14]比較豬胃黏蛋白偶聯磁珠和PEG8000富集檢測了青蔥和葡萄中的諾如病毒，結果顯示對青蔥來說，高接種量下兩種富集方法回收率差不多，低接種量下豬胃黏蛋白偶聯磁珠法的回收率高于PEG8000，而對于葡萄來說，豬胃黏蛋白偶聯磁珠法高低接種量的回收率均高于PEG8000，顯示PGM-MB法富集效果要好于PEG8000，這與研究[13]的結果是吻合的。徐奮奮等[15]將不同濃度的GⅡ型諾如病毒加入水中，用鈣離子法富集，研究結果顯示鈣離子富集法對水中GⅡ型諾如病毒的檢測回收率可以達到81.6%，檢測靈敏度達到10copies/μL，均較好，且具備快速簡便的優點，適用于基層實驗室進行水中GⅡ型諾如病毒的快速檢測。

2.4反轉錄-環介導等溫擴增 羅劍鳴等[16]建立了一種基于顏色判定的GⅡ型諾如病毒的RT-LAMP檢測技術，通過擴增前加入羥基萘酚藍染料，以顏色變化判斷結果，結論顯示此方法與常規RT-PCR相比靈敏度相當，檢測效率更高，可用于GⅡ型諾如病毒的現場快速檢測。

2.5基因芯片 史蕾等[17]用鏈霉親和素包被的磁珠作標記物，以生物素標記的核算為樣本，通過它們的親和作用，進行核算雜交檢測，建立了基于磁珠的可視化基因芯片檢測諾如病毒，結論顯示該方法靈敏度、特異性、重復性均較好，且具有快速、直觀的優點。

2.6酶聯免疫吸附測定 溫來欣等[18]建立了異硫氰算熒光素（FITC）-抗FITC放大系統的檢測人糞便中諾如病毒抗原的ELISA法，通過與商業化酶聯免疫法試劑盒比對，得出該方法靈敏度、特異性均較好，且具有成本低的優點。

3 總結

依據諾如病毒的污染途徑，糞便、食品、水成為了諾如病毒檢測的主要樣本，糞便的檢測技術的研究相對更成熟，對于食品和水來說，怎樣合理有效的將病毒富集，避免過程的損失成為檢測靈敏度是否滿足要求的決定性環節，故食品和水中諾如病毒檢測的相關研究聚焦于病毒的富集技術是必要的。

諾如病毒的檢測技術發展至今，實時熒光定量RT-PCR技術因其具備可靠的靈敏度、特異性等優勢已經成為應用最為廣泛的檢測技術，同時為了適應疫情暴發的及時處置，一些更加適合現場快速檢測的試劑條、試劑盒等技術也正在快速發展。對研究者來說，怎樣處理好準確靈敏與簡便高效這二者之間的平衡對諾如病毒檢測技術的發展具有重要意義。

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收稿日期：2017-7-8；修回日期：2017-8-12

編輯/成森endprint