miR-141及MMP-16對骨性關節炎疼痛及軟骨損傷的影響

胡 玲，馬 垚，胡 冰，余文雄，左 毅

(武漢科技大學附屬天佑醫院，湖北 武漢 430064)

骨性關節炎(OA)是一種以關節軟骨變性、破壞及骨質增生為特征的慢性疼痛性疾病。我國OA患病率約為15%，同時伴隨年齡的增長，其患病率不斷升高，最終導致殘疾[1-2]。近年來的研究表明，微小RNA(miRNA)具有調節軟骨發育及維持軟骨代謝平衡的作用，通過對其下游多靶點基因的干預，可調節軟骨細胞分化、生長和修復，從而影響OA的病變過程[3]。miR-141是OA患者血液中具有高度特異性的miRNAs，其降低與關節軟骨細胞凋亡和炎癥相關，可影響OA的進展；同時其可通過對炎性因子及神經細胞中致痛因子的調控，從而對OA產生的疼痛具有調節作用[4]。miR-141家族在OA患者軟骨組織中的表達明顯高于正常組織[5],生物信息學分析發現其能被特定的基質金屬蛋白酶-16(MMP-16)所調控而影響骨關節炎的進展。因此如何在早期阻斷關節軟骨的損傷，減輕或消除疼痛，改善關節功能，降低致殘率是OA研究領域中的重要課題。本實驗擬通過觀察OA模型大鼠背角神經元中miR-141及軟骨組織中MMP-16的表達情況來探究它們的相關性及功能意義，以期為OA嚴重程度的判斷及靶向治療提供新思路和理論依據。

1 實驗資料

1.1 動物 健康雄性SD大鼠30只，體質量250～300 g，武漢大學實驗動物中心提供。分籠進行飼養，自由飲食。環境溫度20～26 ℃，濕度50%～70%，晝夜節律以1∶1進行調節。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗大鼠MMP-16抗體(博士德BA1280)，兔二步法檢測試劑盒(中杉金橋PV-6001)；miScript Ⅱ反轉錄試劑盒(QIAGEN-218161)、miScript SYBR Green PCR 檢測試劑盒(QIAGEN-218073)、1% 瓊脂糖、漩渦振蕩機(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；Heraguard EC 超凈工作臺( 美國 Thermo Scientific公司) ；單道可調移液器(德國 Eppendorf 公司)；CFX96 熒光定量PCR儀(美國 Bio-Rad 公司)；Power Pac Basic 電泳儀(美國 Bio-Rad 公司)；水平電泳槽(美國 Bio-Rad 公司)。

1.3 分組及造模 將SD大鼠編號后，隨機分為實驗組20只和對照組10只。采用苯巴比妥麻醉大鼠，仰臥位固定，以左側膝關節作為手術側，常規備皮消毒。髕旁內側切口顯露膝關節，暴露髕骨后向外側脫位，盡量屈曲膝關節顯露前交叉韌帶，實驗組直視下切斷前交叉韌帶，抽屜試驗確認完全切斷后徹底止血，將髕骨復位，1號絲線逐層閉合關節腔。對照組不切斷前交叉韌帶，其余處理同實驗組。術后大鼠手術側給予固定，分籠飼養，每只大鼠肌注青霉素20萬IU/d預防感染，連續術后3 d。

1.4 冷痛閾測定 分別在手術前連續3 d以及手術2，8周后，于每天上午的固定時間點進行測量。測量前將大鼠靜置入多孔鋼絲籠中，適應環境15 min后，在右側皮區(右側為優勢區，更加敏感)懸滴0.5 mL冷丙酮，記錄滴下冷丙酮后1 min內后爪抓撓皮區或理毛的次數，重復測量3次，每次間隔5 min，取3次記錄值的平均值作為冷痛閾值。

1.5 軟骨組織病理切片觀察 2組分別于手術2，8周后各斷頸處死一半大鼠，取2 cm×0.5 cm軟骨組織，經生理鹽水沖洗后，即行多聚甲醛固定、脫鈣、沖洗、脫水、透明、石蠟包埋、切片，通過蘇木精-伊紅染色觀察大鼠骨關節的形態變化。

1.6 背根神經節組織中miR-141表達檢測 采用RT-PCR法檢測。斷頸處死大鼠后取L4—6脊髓組織，分離出雙側脊髓背角組織，提取總RNA，在熒光定量PCR儀上按照標準步驟進行反應。按照反應體系配置說明配備總反應液25 μL：其中2×Quantiect SYBR Green PCR 12.5 μL，10×miscript Universal Primer 2.5 μL，10×miscript Primer Assay 141 2.5 μL，RNase-free water 5 μL，Template CDNA 2.5 μL，每個樣本設3個復孔，反應條件為：95 ℃預變5 min，1個循環。15 s 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 70 ℃，40個循環。計算2-ΔΔCT值進行定量分析，2-ΔΔCT值表示目的基因相對表達量。

1.7 MMP-16蛋白表達檢測 采用免疫組化法檢測。取4 μm厚的軟骨組織切片，常規脫蠟至水，0.3% H2O2孵育10 min阻斷內源性過氧化物酶。0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，將切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽抗原修復液(pH=6.0)，高壓2 min抗原修復，冷卻至室溫。0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，滴加一抗(MMP-16濃度為1∶200)，4 ℃冰箱孵育過夜。0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，滴加生物素標記的二抗，室溫孵育30 min。0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照。鏡下陽性細胞核呈深淺不一的棕色，隨機10個視野下計數陽性著色細胞。

2 結 果

2.1 手術前后大鼠冷痛閾值比較 手術2，8周后，對照組大鼠對冷丙酮刺激的陽性反應次數未見明顯變化(P均>0.05)；實驗組大鼠對丙酮刺激的陽性反應次數明顯高于對照組(P<0.05)，并且隨著時間的延長，陽性反應次數明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 2組大鼠手術前后冷痛閾值比較次)

注：①與手術前1 d比較，P<0.05；②與手術后第2周比較，P<0.05；③與對照組比較，P<0.05。

2.2 大鼠滑膜軟骨組織HE染色表現 對照組大鼠假手術2周和8周后HE染色表現無明顯變化，軟骨細胞形態扁平，排列整齊，結構清晰，無炎性細胞浸潤，無充血增生，間質內無纖維化。實驗組大鼠手術2周后軟骨細胞發生收縮，數量增多、排列紊亂，基質染色減退，此時發生以巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞為主的急性炎性細胞浸潤，可見明顯的增生血管和輕度纖維化；手術8周后，大鼠軟骨細胞數量明顯減少，形態消失，可見成團積聚的炎癥細胞出現，同時組織裂隙較深，基質不可染色，出現關節結構的改變。見圖1～3。

圖1 假手術2周后對照組大鼠滑膜軟骨組織HE染色表現 (×100)

2.3 大鼠背根神經節組織中miR-141相對表達量 手術2，8周后，實驗組大鼠背根神經節組織中miR-141相對表達量均明顯高于對照組(P均<0.05)，且手術8周后明顯高于手術2周后(P<0.05)。見表2。

圖2 手術2周后實驗組大鼠滑膜軟骨組織HE染色表現(×100)

圖3 手術8周后實驗組大鼠滑膜軟骨組織HE染色表現(×100)

組別n手術2周后手術8周后對照組513.43±2.3414.54±3.82實驗組1028.54±62.72①34.56±7.98①②

注：①與對照組比較，P<0.05；②與手術2周后比較，P<0.05。

2.4 大鼠軟骨組織中MMP-16蛋白表達情況 對照組大鼠假手術2，8周后骨組織中MMP-16蛋白表達量比較差異無統計學意義(P均>0.05)；實驗組大鼠手術2，8周后骨組織中MMP-16蛋白表達量均明顯高于對照組(P均<0.05)，且手術8周后明顯高于手術2周后(P<0.05)。見圖4～6。

圖4 假手術2周后對照組大鼠軟骨組織中MMP-16蛋白表達情況(×100)

3 討 論

OA作為一種累及關節軟骨的慢性退行性病變，其病因尚不清楚，患者主要表現為關節疼痛及腫脹，這與軟骨及其微環境的合成代謝障礙所致的胞外基質(ECM)退化和關節軟骨的損傷有關，隨著軟骨的破壞、外界機械因素刺激以及游離物質的析出，導致疼痛加劇及關節活動受限，最終出現關節畸形[6-7]。miRNAs是一類長度為22個小核苷酸，來源于內源染色體上的非編碼單鏈RNA，它們在進化上具有高度的保守性，能夠通過與靶mRNA特異性的堿基互補配對，引起靶mRNA 降解或抑制其翻譯，從而調控基因進行轉錄后的表達。參與細胞增殖凋亡、器官形成、炎癥免疫應答、炎性疼痛、腫瘤發生等進程[8]，近年來研究表明miRNAs的表達差異與OA發生、發展過程中關節軟骨破壞、軟骨細胞凋亡、滑膜炎癥以及疼痛等病理變化關系密切[9]。miR-141是一種在軟骨組織中表達的miRNAs。張文明[5]發現在成骨過程中，miR-141是成骨負性調節因子，它通過轉錄后抑制降低Dlx5/Msx2/Runx2信號軸的級聯作用，減少成骨表達和成骨作用。申發娟等[10]研究發現miR-141高表達的胃腺癌SGC-901細胞E-cadherin表達增加，N-cadherin、MMP-9表達減少，細胞遷移減少。這些都提示miR-141與骨細胞代謝生長、腫瘤、炎癥有密切關系。本實驗發現，實驗組手術2，8周后背根神經節組織中miR-141表達量均明顯高于對照組，且手術8周后高于手術2周后，表明隨著OA的發展，miR-141呈現持續上升的趨勢。另外手術2周和8周后實驗組大鼠對丙酮刺激的陽性反應次數明顯高于對照組，且隨著病情進展其陽性反應次數明顯增加。推測脊髓背根神經元中miR-141升高可以導致OA疼痛的發生，并可反映嚴重程度。

圖5 手術2周后實驗組大鼠軟骨組織中MMP-16蛋白表達情況(×100)

圖6 手術8周后實驗組大鼠軟骨組織中MMP-16蛋白表達情況(×100)

隨著分子生物學的快速發展，MMP-16在OA發病中的作用備受關注。Nobuaki等[11]發現IL-1β通過Wnt16信號通路誘導MMP-16產生并促進成骨細胞的增殖，但在OA患者中發現MMP-16不僅可以降解ECM，而且也可以激活MMP-2在酶原水平上調節細胞外基質降解，這都促進了OA的發展[12]。Zhang等[13]證實下調miR-155可以導致MMP-16的基因表達增加，降解ECM，從而引起椎間盤疾患，而上調MMP-16的表達可達到治療腰椎間盤突出的作用。本實驗發現，實驗組大鼠手術2，8周后骨組織中MMP-16蛋白表達量均明顯高于對照組，且手術8周后明顯高于手術2周。這表明MMP-16在OA的病理過程中起到降解軟骨細胞，促進病情發展的作用。

綜上所述，在OA的發展過程中，脊髓背角細胞中的miR-141可導致關節疼痛，而MMP-16可以競爭性地降解軟骨細胞ECM，促進OA的發展。兩者相互作用促進病情的發展，最終可能導致OA晚期出現關節疼痛和畸形，但兩者之間如何互相調節還有待于進一步研究。

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