煤炭腐植酸對能源草柳枝稷耐鹽性的促進作用

常 青 ，武文麗，黃高鑒，張訓忠，楊治平

（1.山西大學生物工程學院，山西 太原 030006；2.山西省農業科學院農業環境與資源研究所，山西 太原 030031；3.美國弗吉尼亞理工大學土壤環境科學學院，美國 弗吉尼亞 24061）

鹽漬土簡稱鹽堿土，在我國鹽漬土面積大約有66.1萬hm2，山西有1.7萬hm2[1]。鹽堿地改良治理和開發利用在我國的農業發展歷史上一直是一個比較嚴峻的問題，鹽漬土對大多數作物會產生不同程度的危害，影響作物正常生長發育，降低作物產量，從而阻礙了農業的發展[2-5]。柳枝稷是低地型的多年生草本植物，原產于美國，它的土壤適應性很強，即使在非常貧瘠、洪澇、干旱和鹽堿的環境下依然可以生長[6-7]。

植物抗氧化代謝與耐鹽有一定關聯，抗氧化酶可以消除自由基[8]。不同抗氧化酶的功能各有不同，在不同植物中起作用的抗氧化酶也不同。有研究表明，生長調節物質可以提高作物的耐鹽性[9]。腐植酸是一種復雜的含有羧基、酚羥基等活性官能團的混合物，廣泛存在于土壤有機質、泥炭、褐煤、風化煤及湖泊和海洋沉積物中，是由有機生物死亡后經生物降解所產生[10]。腐植酸在農業方面上的應用，國內外均已進行了大量的研究，并確認了腐植酸可促進植物新陳代謝，提高多種酶活性、葉綠素含量及植物抗逆能力[11-12]。

探討耐鹽植物選育研究的進展，對于進一步推動耐鹽植物選育研究，加快鹽堿地植被恢復具有重要意義。目前腐植酸對柳枝稷耐鹽性的相關報道很少，是一個很新穎的研究方向。關于腐植酸對葉片的各項生理指標、抗氧化代謝及耐鹽能力的影響機理還不清楚，本試驗通過研究不同濃度的腐植酸處理對柳枝稷生長的影響，確定煤炭腐植酸對能源草柳枝稷耐鹽性的促進作用，并選出適宜柳枝稷生長的腐植酸濃度。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

供試柳枝稷品種為阿拉莫（Alamo），于2017年3月在大同毛皂實驗基地采種。

腐植酸為用KOH提取風化煤得到的產物，純度在40%～50%，由山西省農業科學院環境與資源研究所提取。

1.2 試驗設計

2017年4月，挑選大小一致、飽滿的柳枝稷種子，用過2 mm篩的沙土在人工氣候箱中育苗，晝夜溫度設為28℃/20℃，光照時間為14 h/10 h，光強為400 lx。待長至2片葉時，移植到花盆中，放置到人工氣候箱中培養至4片葉后，40 d后開始進行腐植酸處理。

試驗隨機區組排列，每處理重復5次。鹽脅迫處理（先噴施腐植酸，再灌施NaCl溶液，且灌施NaCl溶液時成梯度進行，3 d后達到250 mmol/L）（表1）7 d后，取樣備測。

表1 不同處理的鹽濃度和腐植酸濃度

1.3 測定方法

1.3.1 葉片相對含水量 取第2片完全展開葉約50 mg，用剪刀剪成5 mm的片段，記錄鮮質量（FW）后，立即放入2 mL的離心管中并加入1 mL的蒸餾水（保證所有葉片都浸入水中）。放入4℃冰箱12 h后，放入平板上用紙巾擦干，記錄含水量（TW）；之后放入75℃的烘箱中，烘干24 h，記錄干質量（DW）。葉片相對含水量（RWC）計算公式如下。

1.3.2 電解質外滲 取第2片完全展開葉約50 mg，用剪刀剪成5 mm的片段，記錄質量后，放入50 mL的帶蓋離心管中（耐高溫），并加入20 mL的蒸餾水，蓋好蓋子放置搖床震蕩24 h，測定EC1；去掉蓋子，用錫箔紙包緊放入120℃的高溫滅菌鍋中30 min，測定EC2。葉片電導率（EC）計算公式如下。

1.3.3 光合作用參數 使用LI-6400XT光合儀測量光合速率、氣孔導度、蒸騰速率，記錄并整理數據。

1.3.4 葉綠素 使用葉綠素儀，每組處理的每片葉子測量3個位置，并記錄整理，得出結果。

1.3.5 葉片抗氧化物活性

1.3.5.1 超氧化物歧化酶（SOD） 取新鮮樣品并立即用液氮冷凍，冷凍樣品儲存于-80℃。用研缽（含液氮）研磨樣品并在2 mL微量離心管中稱100 mg樣品，加入1.8 mL提取溶液（0.05 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 值為 7.0；0.2 mmol/L EDTA，1%（w/v）PVP）充分混合，并且將混合物在冰浴中停留約30 min。以12 000 r/min 4℃離心20 min。收集上清液（0.8 mL）并轉移到新的微量離心管中，用于酶活性分析。

準備具有均勻顏色和質地或比色杯的干凈的試管，并將以下試劑轉移到管中：50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 值 7.8，0.9 mL），10 μL的 10 mmol/L EDTA，30 μL的 SOD（超氧化物歧化酶），100 μL的0.13mol/L甲硫氨酸，10 μL的6.3mmol/LNBT，10 μL的130 μmol/L核黃素。用石蠟膜密封后充分混勻。將試管放入玻璃支架中，在25℃下打開環形熒光燈（輻照度為60 μmol/（m2·s））開始反應，關閉燈10 min后停止反應。開始時保持器中的試管放置在旋轉器上，使得每個樣品在反應期間接收相同量的光。反應后，用分光光度計測量560 nm處的吸光度，記錄并整理數據。

1.3.5.2 抗壞血酸過氧化物酶（APX） 準備清潔的試管，顏色均勻，質地好，試管中加入：50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 值為 7.0，0.87mL），10 μL的 50mmol/L抗壞血酸，10 μL 的 10 mmol/L EDTA，100 μL 抗壞血酸過氧化物酶提取物。采用石蠟膜密封比色杯，并充分混勻。加入10 μL10 mmol/LH2O2開始反應，并立即測量290 nm處的吸光度，1 min后測量第2次。

1.3.5.3 過氧化氫酶（CAT） 準備具有均勻顏色和質地的干凈試管，將以下試劑轉移到管中：50mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 值為 7.0，0.96 mL），10 μL 的1.5 mol/L H2O2。加入30 μL酶提取物，立即測量240 nm處的吸光度，反應1 min后測量第2次。反應開始后使用緩沖液作為空白。

1.4 數據處理

試驗數據采用SPSS軟件進行單因素方差分析，采用Duncan新復極差法比較不同數據組間的差異，顯著性水平設定為α＝0.05；使用Excel柱狀圖分析變化。

2 結果與分析

2.1 施用不同濃度腐植酸處理鹽脅迫下柳枝稷的葉片相對含水量變化

由圖1可知，在煤炭腐植酸的處理下，隨著鹽處理天數的增加，柳枝稷葉片的相對含水量出現一定程度的變化。第1次取樣5組處理的葉片相對含水量不存在顯著性差異；7 d后，不同處理的葉片相對含水量發生一定程度的變化。處理1（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）、處理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）、處理 3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）和處理 4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）與對照組的葉片含水量存在顯著性差異，且較對照組明顯下降了20%～30%；處理1與處理2、處理3和處理4存在顯著性差異；處理2、處理3、處理4之間不存在顯著性差異，處理2、處理3與處理4葉片相對含水量比處理1的葉片相對含水量下降少。

不同濃度的腐植酸處理下，對柳枝稷耐鹽性的影響程度不同。一定濃度的腐植酸可以相對降低葉片水分的散失。本試驗結果表明，施用0.2%和0.4%濃度的腐植酸可以減少葉片水分的散失，從外觀看可以維持鹽脅迫下柳枝稷的正常生長。

2.2 施用不同濃度腐植酸處理鹽脅迫下柳枝稷葉片的電解質外滲變化

從圖2可以看出，在煤炭腐植酸的處理下，隨著鹽脅迫處理的天數增加，柳枝稷的葉片電解質外滲的變化較大。第1次取樣5組處理的葉片電解質外滲不存在顯著性差異；7 d后，不同處理的葉片電解質外滲發生變化。處理1（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）、處理2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）、處理 3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）和處理4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）較對照組顯著增加，增加了40%～50%；處理1較處理2、處理3和處理4增加的最大，處理2、處理3和處理4之間不存在顯著性差異，但處理3葉片的電解質外滲上升的最少，上升了40%。

不同濃度的腐植酸處理下，對柳枝稷耐鹽性的影響程度不同。一定濃度的腐植酸可以降低葉片電解質外滲的增加。本試驗結果表明，施用0.2%的腐植酸可以減少鹽分的積累，減少對植株的危害。

2.3 施用不同濃度腐植酸處理鹽脅迫下柳枝稷葉片的光合速率變化

由圖3可知，在煤炭腐植酸的處理下，隨著鹽處理天數的增加，柳枝稷葉片的光合速率出現了一定程度的變化。第1次取樣5組處理的葉片光合速率不存在顯著性差異；第7天不同處理的葉片光合速率發生變化。處理1（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）、處理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）、處理 3（250mmol/LNaCl；0.2%腐植酸）和處理 4（250mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）較對照組均顯著減少。處理1與對照組、處理2、處理3和處理4間存在顯著性差異，受鹽脅迫影響最大，葉片光合速率降低最多。處理3的葉片光合速率為處理1、處理2和處理4中下降最少的，與處理2和處理4的葉片光合速率間不存在顯著性差異。

2.4 施用不同濃度腐植酸處理鹽脅迫下柳枝稷葉片的氣孔導度變化

由圖4可知，在煤炭腐植酸的處理下，隨著鹽處理天數的增加，柳枝稷葉片的氣孔導度出現了一定程度的變化。第1次取樣5組處理的葉片氣孔導度不存在顯著性差異；鹽處理7 d后，不同處理的葉片氣孔導度發生變化。對照組的葉片氣孔導度變化與其他4組存在顯著性差異；處理2（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）與處理 1（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）葉片氣孔導度變化不存在顯著性差異，但與處理 3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）和處理 4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）的葉片氣孔導度變化存在顯著性差異，顯著下降80%左右；處理3與處理4葉片的氣孔導度變化不存在顯著性差異。

施用0.2%，0.4%的腐植酸可以一定程度的減少葉片氣孔導度的下降，使柳枝稷的氣孔開張程度維持相對正常狀態。氣孔導度過低，使得氣孔關閉，嚴重影響細胞的正常運轉。

2.5 施用不同濃度腐植酸處理鹽脅迫下柳枝稷葉片的蒸騰速率變化

由圖5可知，在煤炭腐植酸的處理下，隨著鹽處理天數的增加，柳枝稷葉片的蒸騰速率出現了一定程度的變化。第1次取樣5組處理的葉片蒸騰速率不存在顯著性差異；但鹽處理7 d后，不同處理的葉片的蒸騰速率發生變化。處理1（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）、處理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）、處理 3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）和處理 4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）較對照組顯著下降，處理3、處理4的葉片蒸騰速率變化不存在顯著性差異，處理1下降程度最大。

不同濃度腐植酸處理對柳枝稷耐鹽性的影響程度不同。一定濃度的腐植酸可以增加凈光合速率、調節氣孔導度及蒸騰速率。本試驗結果表明，施用0.2%的腐植酸可以顯著增加柳枝稷葉片的凈光合速率、調節氣孔導度、降低蒸騰速率、防止生理干旱。蒸騰速率的下降可以在一定程度上降低葉片水分散失，但下降過多可能會對細胞造成一定程度的傷害，嚴重時可導致植株死亡。

2.6 施用不同濃度腐植酸處理鹽脅迫下柳枝稷葉片的葉綠素含量變化

由圖6可知，在煤炭腐植酸的處理下，隨著鹽處理天數的增加，柳枝稷葉片的葉綠素含量出現了一定程度的變化。第1次取樣5組處理的葉片葉綠素含量不存在顯著性差異；但鹽處理7 d后，不同處理的葉片葉綠素含量發生變化。處理1（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）、處理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）和處理 4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）較對照組顯著減少；處理 3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）與對照組間不存在顯著性差異。鹽處理后，4組葉綠素含量都降低了，處理3（除對照組外）較其他3組下降的程度最少。

2.7 對葉片的抗氧化酶活性影響

2.7.1 施用不同濃度腐植酸處理鹽脅迫下柳枝稷葉片的超氧化物歧化酶活性變化 由圖7可知，在煤炭腐植酸的處理下，隨著鹽處理天數的增加，柳枝稷葉片的超氧化物歧化酶活性出現了一定程度的變化。第1次取樣5組處理的葉片超氧化物歧化酶活性不存在顯著性差異；7 d后，不同處理的葉片超氧化物歧化酶活性發生變化。處理1（250 mmol/L NaCl；0%腐植酸）、處理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）與對照組間不存在顯著性差異；處理3（250mmol/LNaCl；0.2%腐植酸）和處理4（250mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）的葉片超氧化物歧化酶活性存在顯著性差異，2組處理較對照組都顯著增加，且處理3增加的幅度最大。

2.7.2 施用不同濃度腐植酸處理鹽脅迫下柳枝稷葉片的抗壞血酸過氧化物酶活性變化 由圖8可知，在煤炭腐植酸的處理下，隨著鹽處理天數的增加，柳枝稷葉片的抗壞血酸過氧化物酶活性出現了一定程度的變化。第1次取樣5組處理的葉片抗壞血酸過氧化物酶活性不存在顯著性差異；但鹽處理7 d后，不同處理的葉片抗壞血酸過氧化物酶活性發生變化。處理1（250 mmol/LNaCl；0%腐植酸）、處理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）較對照組不存在顯著性差異；處理 3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）和處理 4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）的葉片抗壞血酸過氧化物酶活性不存在顯著性差異，2組處理較對照組都顯著增加；處理3和處理4增加的幅度最大。

2.7.3 施用不同濃度腐植酸處理鹽脅迫下柳枝稷葉片的過氧化氫酶活性變化 由圖9可知，在煤炭腐植酸的處理下，隨著鹽處理天數的增加，柳枝稷葉片的過氧化氫酶活性出現了一定程度的變化。第1次取樣5組處理的葉片過氧化氫酶活性不存在顯著性差異；但鹽處理7 d后，不同處理的葉片過氧化氫酶活性發生變化。處理1（250 mmol/LNaCl；0%腐植酸）、處理 2（250 mmol/L NaCl；0.1%腐植酸）與對照組不存在顯著性差異；處理3（250 mmol/L NaCl；0.2%腐植酸）和處理 4（250 mmol/L NaCl；0.4%腐植酸）的葉片過氧化氫酶活性存在顯著性差異；處理3的葉片過氧化氫酶活性最高。

3 結論與討論

3.1 結論

施用腐植酸對鹽脅迫下的柳枝稷有一定的促進作用，可以適當提高柳枝稷葉片的相對含水量、葉綠素含量、光合速率、氣孔導度、葉片蒸騰速率以及抗氧化酶含量，適當降低電解質外滲。本試驗得出適宜腐植酸濃度可適當增強柳枝稷的耐鹽性，其中，施用0.2%的腐植酸在本試驗中的作用最大，綜合效果最好。

3.2 討論

本研究表明，一定濃度的鹽脅迫會傷害柳枝稷。試驗第7天，鹽脅迫對柳枝稷傷害明顯，葉片出現萎蔫發黃現象。造成的原因應該是基質保水性太強，澆水量大造成柳枝稷根系呼吸困難，生長受抑制。這與前人[13-14]的研究結果有所不同。以后研究柳枝稷耐鹽機理時，應適當減少鹽濃度梯度。

本試驗結果表明，腐植酸可以適當提高鹽脅迫下柳枝稷葉片的葉綠素和光合速率。前人研究表明，光合速率對柳枝稷耐鹽性而言，是一個非常重要的指標[15]。處理 3（250 mmol/LNaCl；0.2%腐植酸）經過7 d的鹽處理后光合速率較其他組鹽處理的光合速率最高，說明腐植酸可增加它的光合速率從而增強柳枝稷葉片的耐鹽性。蒸騰作用降低可以使細胞減少水分的散失，維持細胞正常的生理活動。蒸騰作用有2種方式，一種是根壓，它是在植物小的時候所才用的主要吸水方式，因為沒有葉片。當植物長出葉片是就采用蒸騰拉力來吸收水分。蒸騰作用所產生的蒸騰拉力為植物輸送水分以及礦物質，也為植物進行光合作用提供營養源[16]。施加腐植酸后，光合速率和蒸騰速率二者促進柳枝稷的正常生長，減小鹽脅迫的危害，從而提高了植株的耐鹽性。

植物對耐鹽性存在一種防衛機制。3種酶的抗氧化原理表明，它們無害，具有一定的促進作用[17]。SOD，APX，CAT的活性高可以提高柳枝稷葉片的長勢，消除自由基，從而增強它的耐鹽性[18]。但是三者之間的功能有些不同，消除的自由基的種類也不相同，主要取決于當時細胞內的情況。雖然有些酶活性比較低，但不能排除其作用大的可能，若要準確確定某種酶的作用機制需要測量中排除其他酶。

滲透調節也可以一定程度的影響耐鹽性[19]。鹽脅迫能一定程度使得細胞吸水受抑制。前人研究證明，脯氨酸的積累可以減少細胞吸水的限制[19-20]。但是怎樣的調節還不清楚，可能是一種信號分子誘導合成，可以測定葉片脯氨酸的含量，探究脯氨酸的調節機制。

本試驗只是初步研究腐植酸對柳枝稷的耐鹽性的影響，其中每個指標研究的次數過少，所以，只能預測整體趨勢。下一步應需要完善方案，進行深入的研究。

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