PMP-HPLC法測定太子參中葡萄糖的含量

,2*

1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2. 福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003

福建道地藥材太子參中含有豐富的多糖。國內學者和本課題組研究表明，太子參多糖具有降低血糖、血脂、改善胰島素抵抗，還具有心肌保護、增加免疫功能等作用，是太子參主要有效成分之一；太子參多糖降血糖、減少胰島素抵抗，抗2型糖尿病(T2DM)具有潛在的實用價值[1-3]。多糖的單糖組成分析是進行多糖質量控制和獲取多糖基本信息的重要環節，課題組前期工作證實太子參多糖中存在大量的葡聚糖[4-5]；鑒于目前2015年版《中華人民共和國藥典》太子參藥材的質量標準中尚未制定含量測定指標，筆者從多糖入手，建立單糖葡萄糖含量測定的方法，為完善中藥太子參的質量標準奠定基礎。

有關太子參多糖含量測定的研究很多，檢測多糖的方法有分光光度法、高效液相-蒸發光散射法、酶聯免疫法、電化學法[6-9]，但其單糖組成迄今少見報道。對糖類物質而言，其化學結構中不含生色團，不產生紫外光吸收，多數不產生熒光，無法通過紫外或熒光直接檢測而是將多糖水解成單糖后進行測定。因此筆者采用高溫強酸水解的方法將太子參多糖水解為單糖，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)為衍生物，在堿性條件下與單糖縮合生成單糖-PMP衍生物，高效液相色譜(HPLC)法測定單糖的含量[10]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DIONEX Ultimate 3000雙三元高效液相色譜系統(包括Ultimate 3000 DAD檢測器、Chromeleon 7.1 數據處理系統，美國DIONEX公司)；AE240S型電子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；BARNSTEAD TⅡ型超純水機(美國Thermo公司)。

1.2 材料 太子參(購自福建柘榮太子參市場)；：D-無水葡萄糖對照品(≥99.9%，批號：110833-201506，中國食品藥品檢定研究院)。色譜純甲醇(批號：1880707710、德國Merck公司)，色譜純乙腈(批號：167265、美國Fisher公司)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(批號：BCBP1308V，美國SIGMA公司)，三氟乙酸(批號：C1713014，aladdin公司)，無水乙醇(批號“20170424)、磷酸二氫鉀(批號：20170324)、甲醇(批號：20170712)等均為國藥集團化學試劑有限公司產品，水為電阻率為18.2Ω的超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用大連依利特HypersiL BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，檢測波長為250 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，進樣量20 μL。流動相：溶劑A，15%(v/v)乙腈+50 mmol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)，溶劑B，40%(v/v)乙腈+50 mmol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)，梯度洗脫(0～10 min，100%～90% A；10～30 min，90%～80% A；30～40 min，80% A；40～45 min，80%～100% A)

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定葡萄糖對照品104.08 mg，加蒸餾水溶解至5 mL容量瓶中，搖勻，得濃度為20.82 mg/mL的對照品溶液，作為標準母液。分別精密量取標準母液0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、1.50 mL，加水定容至2 mL，配制成濃度為0、0.52、1.04、2.08、5.21、10.41、15.62 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 乙醇脫脂與多糖提取 稱取太子參(粉碎過3號篩)1.0 g，精密稱定，加入乙醇100 mL，加熱4 h，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，準確加水50 mL、稱重，水浴加熱回流提取2 h，放冷后加水補重，混勻，離心，取上清液備用。

2.3.2 三氟乙酸水解 準確吸取上述溶液2 mL，準確加入0.6 mL市售三氟乙酸，1.4 mL的蒸餾水，使溶液總體積為4.0 mL(三氟乙酸終濃度2mol/L)，于110 ℃烘箱中水解4 h；水解后，轉移至100 mL圓底燒瓶，加入3 mL甲醇旋轉蒸干，重復4次。加超純水溶解樣品，轉移至2mL容量瓶中，以制得供試品溶液。

2.4 衍生化產物的制備 準確吸取對照品溶液和供試品溶液各100 μL，加入50 μL的0.6 mol/L NaOH溶液，100 μL的0.5 mol/L PMP甲醇溶液，混勻，在70 ℃烘箱反應90 min；冷卻至室溫，準確加入100 μL的0.3 mol/L HCL中和，加水定容至2 mL；轉移至具塞塑料試管中，加2 mL氯仿，振搖，離心，棄去氯仿相，重復萃取3次，取水相用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用，供HPLC分析。

2.5 線性關系的考察 準確吸取各對照品溶液100 μL，各3份，按“2.4項”下進行PMP柱前衍生化，按“2.1項”下色譜條件測定。以葡萄糖濃度為橫坐標，峰面積平均值為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，為y=41211.2191x-857.2319，r=0.9990。表明葡萄糖在0.52～15.62 mg/mL線性范圍內線性關系良好。

2.6 精密度試驗 精密吸取供試品溶液20 μL，按“2.1項”下色譜條件重復進樣6次。計算太子參中葡萄糖的含量RSD為0.60%，說明該儀器的精密度良好。

2.7 重復性試驗 稱取太子參(粉碎過3號篩)1.0 g，6份，精密稱定，按“2.3項”下方法制備樣品溶液，按“2.1項”下的色譜條件進行測定，結果太子參中葡萄糖平均含量為20.22%，RSD為1.64%，結果表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗 稱取太子參(粉碎過3號篩)1.0 g，精密稱定，按“2.3項”下方法制備樣品溶液，于0 h、6 h、12 h、24 h、48 h，按“2.1項”下的色譜條件進行測定，計算葡萄糖的含量RSD為1.06%，說明該供試品溶液在48 h內穩定。

2.9 加樣回收試驗 準確吸取已知含量的樣品溶液9份，分別加入葡萄糖對照品溶液適量，使得高、中、低濃度對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比為1.5∶1，1∶1，0.5∶1各3份，按“2.3項”下進行PMP柱前衍生化，按“2.1項”下的色譜條件測定，計算回收率。葡萄糖的平均加樣回收率為97.96%、99.45%、104.29%。

2.10 樣品含量測定 分別稱取3個批次的太子參1.0 g，精密稱定，每個批次平行3份，按“2.3項”下方法制備樣品溶液，按“2.1項”下的色譜條件進行測定，計算太子參藥材中葡萄糖含量。色譜圖如圖1所示，結果見表1。

表1 太子參樣品葡萄糖含量測定結果

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 配制一定濃度的葡萄糖對照品溶液，在210～400nm波長內進行全波長掃描，結果發現葡萄糖在250nm處有最大吸收如圖2所示，本實驗選擇250nm波長為檢測波長。

圖2 葡萄糖對照品(0.4 mg/mL)210～400 nm波長掃描圖

3.2 供試品溶液制備方法的確定 對太子參樣品量、提取方法以及提取時間進行考察，篩選出合理的提取方法。采用三氟乙酸水解太子參多糖溶液，將太子參多糖水解為單糖，以PMP為衍生物，在堿性條件下與單糖縮合生成單糖-PMP衍生物，應用高效液相色譜法分析測定太子參中單糖主成分—葡萄糖的含量。

4 結論

綜上所述，采用高溫強酸水解的方法將太子參多糖水解為單糖，利用PMP對其進行衍生化，將衍生化產物用HPLC分析檢測單糖主成分葡萄糖含量。以250 nm為檢測波長；大連依利特HypersiL BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相：溶劑A，15%(v/v)乙腈+50 mmol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH,pH 6.9)，溶劑B，40%(v/v)乙腈+50 mmol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH,pH 6.9)，進行梯度洗脫；建立太子參葡萄糖含量測定方法。本方法重現性好、準確度高，為太子參藥材質量標準的完善奠定基礎。