三七川歸顆粒水溶性成分提取及成型工藝研究

王萍萍張 浩

（1 威海市中心醫(yī)院門診藥劑科，山東 威海 264400；2 長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117）

三七川歸鎮(zhèn)痛顆粒由三七、川芎、當(dāng)歸、藿香、甘草五味藥材組成，具有活血化瘀、消炎止痛、調(diào)節(jié)免疫等功效，臨床可用于治療婦女月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)等癥。

在前期的研究過程中我們已經(jīng)完成了對方中脂溶性成分提取工藝的摸索，并確定了最佳提取工藝。川芎、當(dāng)歸為方中臣藥，二者共有的主要成分為阿魏酸。阿魏酸(ferulic acid)化學(xué)名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，分子式為C10H10O4，易溶于熱水、乙醇、乙酸乙脂等[1-5]，是該處方發(fā)揮消炎鎮(zhèn)痛作用的主要水溶性成分。

綜合前期藥理學(xué)實驗結(jié)果，為充分提取處方中藥材的有效成分，擬采用煎煮法對藥方中水溶性成分進行提取。本試驗以阿魏酸的含量為指標，采用L9(34)正交試驗法對方中藥材的水溶性成分最佳提取工藝進行篩選，并用藥材提取物進行顆粒劑成型工藝的研究。

1 材料

1.1 儀器 電熱數(shù)碼恒溫水浴鍋（金壇市電熱儀器廠）；BP211D電子分析天平（上海精密儀器廠）；LXJ-IIB型離心機（上海安寧科學(xué)儀器廠）；UV-935型紫外可見分光光度計（大連依利特儀器公司）；DZF-6050型真空干燥箱（天津泰斯特儀器分公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；島津液相色譜儀（日本島津制作所）；Mini-CG型濕法混合快速制粒機（創(chuàng)志機電科技發(fā)展股份有限公司）。

1.2 試劑 本實驗所用藥材均購于黑龍江千草藥業(yè)股份有限公司；阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院）；色譜甲醇（美國Fisher公司）；色譜乙腈（美國Fisher公司）；鹽酸，磷酸，乙醚均為分析純（北京化工有限公司）；硅藻土（天津康達精細化工有限公司）；碳酸鈉（上海精細化工責(zé)任有限公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結(jié)果

為了最大可能提出處方中藥材的有效成分，乙醇提取后的藥渣需要與川芎、當(dāng)歸二藥合并，繼續(xù)進行水煎操作。

2.1 阿魏酸含量測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱量阿魏酸對照品1.4700mg，置250 mL量瓶中，加85%乙醇使溶解，稀釋至刻度，用微孔濾膜 （0.22 μm） 濾過，濾液另器保存，備用[6-10]。2.1.2供試品溶液的制備 取供試品約1.5 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入4.5 g硅藻土和70 mL純化水，超聲處理15 min，離心25 min（2500 r/min），取上清液35 mL置于分液漏斗中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH=2.5～3.5，用乙醚20 mL，萃取3次，分層，合并乙醚層，用5%Na2CO3溶液萃取3次，每次50 mL，合并水層，稀鹽酸調(diào)節(jié)pH=2.5～3.5，用乙醚45 ml萃取3次，合并乙醚層，揮去溶劑，殘渣用85%乙醇適量使溶解，定容至10 mL，以微孔濾膜濾過 （0.22 μm），即得[6-10]。

2.1.3 測定波長的選擇 取阿魏酸對照品溶液，稀釋到適宜濃度，在290～530 nm波長范圍進行掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 阿魏酸對照品紫外掃描圖

圖1結(jié)果顯示，阿魏酸對照品在315 nm處有最大吸收，結(jié)合文獻報道，確定最大波長為315 nm。2.1.4色譜條件 色譜柱為Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μL）；檢測器為紫外檢測器流動相為 A（79.9%）：水-磷酸二氫鉀-庚烷磺酸鈉，B（20.1%）：乙腈；柱度為30℃；流速為1 mL/min；檢測波長為315 nm。2.1.5系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 取阿魏酸對照品溶液和供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。

圖2 對照品（a）和供試品（b）高效液相色譜圖

圖2結(jié)果表明，供試品中阿魏酸色譜峰與其他色譜峰可以較好分離，其出峰時間與對照品一致。

2.1.6 方法學(xué)考察

2.1.6.1 標準曲線的制備 精密吸取對照品溶液3 μL，5 μL，10 μL，15 μL，20 μL進樣，記錄峰面積，以對照品進樣量（μg）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程為Y=5023.9+1521.7X，R2=0.9997。見表1及圖3。

表1 阿魏酸對照品標準曲線數(shù)據(jù)表

圖3 阿魏酸對照品線性關(guān)系曲線

結(jié)果表明，阿魏酸的含量在3.75～25.00 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.1.6.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，按色譜條件連續(xù)進樣5次，測定峰面積，結(jié)果表明阿魏酸對照品溶液的RSD值為1.94%，證明儀器和所建立的分析精密度良好。

2.1.6.3 重復(fù)性試驗 分別取同一批樣品5份，按照“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，按色譜條件進樣5次，測定峰面積，結(jié)果表明其RSD值為2.26%，證明所建立的試驗方法重復(fù)性良好。

2.1.6.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，在室溫條件下放置，分別在第0、4、8、12、24 h取樣，依法測定峰面積，結(jié)果表明其RSD值為1.72%，證明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6.5 回收率試驗 精密吸取已知含量的供試品溶液5份，精密加入對照品0.013 mg，測定峰面積，計算含量，結(jié)果表明，平均回收率為97.23%，RSD值為2.15%，表明此方法可行。

2.2 水提工藝的考察 根據(jù)文獻報道及預(yù)試驗結(jié)果分析，影響該處方水提工藝的主要因素有加水倍量、提取時間和提取次數(shù)，因此我們分別考察這3個因素，確定其水平范圍。

2.2.1 藥材吸水率的考察 加水量是影響藥材提取效率的主要因素之一，為了使加水量更加準確，需要對藥材的吸水率進行測定。

按處方比例將二氧化碳超臨界及乙醇提取后的藥渣與川芎、當(dāng)歸等藥材混合，共三份，每份120 g，加1000 mL水浸泡至藥材無白芯，濾出全部未被吸收的水液，稱量體積，計算吸水量，求得藥材的吸水率，結(jié)果見表2。

表2 藥材吸水率考察

表2結(jié)果顯示，藥材的吸水率約為215%。

2.2.2 正交實驗因素水平的確定 根據(jù)吸水率測定結(jié)果，藥材吸水率在2倍以上，根據(jù)工廠生產(chǎn)經(jīng)驗，選擇加水量為10、12、14倍量；根據(jù)藥廠一般生產(chǎn)情況，確定煎煮時間分別為1、1.5、2 h，確定煎煮次數(shù)分別為1、2、3次。

2.2.3 正交試驗 采用L9(34)正交試驗法，以提取物中目標物質(zhì)阿魏酸的含量為考核指標，分別稱取處方量藥材9份，按表3中的因素水平設(shè)計提取試驗，濾過，合并濾液，濃縮，干燥至恒重，依法測干膏中阿魏酸的含量，結(jié)果見表4。

表3 正交試驗因素水平表

表4 正交試驗表與結(jié)果

表5 正交試驗方差分析表

以上試驗結(jié)果顯示，以干膏中阿魏酸為評價指標，影響水提工藝因素作用的順序為煎煮次數(shù)＞加水量＞煎煮時間，其中加水量與煎煮次數(shù)的影響具有顯著性差異。綜合考慮，確定最佳水提工藝是A3B1C3，即加入12倍量于藥材質(zhì)量的水，煎煮3次，每次1.0 h。

2.2.4 驗證試驗 取10倍于處方量的藥材，共3份，分別加水12倍量加熱提取3次，每次1.0 h，濾過，濃縮，干燥至恒重，測定阿魏酸含量，結(jié)果提取物中阿魏酸的含量分別為0.4570 mg/g、0.4625 mg/g和0.4545 mg/g，RSD小于2%，證明此工藝穩(wěn)定可行。2.3顆粒成型工藝研究

2.3.1 稀釋劑加入量的考察 復(fù)方鎮(zhèn)痛顆粒的脂溶性和水溶性提取物混合后顏色為棕黑色，藥物顏色雖然與藥效無關(guān)，但可能會影響患者的順應(yīng)性，因此考慮在提取物中加一定量著色劑或稀釋劑調(diào)整顏色。考慮到提取物本身的顏色很深，用著色劑可能不好調(diào)整，因此先采用加稀釋劑的方式對顏色進行調(diào)整。

按生藥量折算脂溶性和水溶性提取物的質(zhì)量，粉碎后過80目篩，按質(zhì)量比加入不同質(zhì)量的淀粉，混合均勻，平鋪于白紙上，觀察[11-15]。結(jié)果見表6。

專業(yè)人才在供需結(jié)構(gòu)及其數(shù)量上的不平衡是造成醫(yī)學(xué)教育管理常見問題最主要的緣由。產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及經(jīng)濟增長方式的不斷轉(zhuǎn)變對于該專業(yè)學(xué)科的畢業(yè)生來說，社會上的供給結(jié)構(gòu)和數(shù)量在不同的階段有著不同的要求，隨著產(chǎn)業(yè)的調(diào)整和市場經(jīng)濟的增長方式的轉(zhuǎn)變會直接要求各大高校對于人才供給的調(diào)整快速采取行動。然而，醫(yī)學(xué)院校繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育專業(yè)設(shè)置比較穩(wěn)定，而且專業(yè)人才的培養(yǎng)需要一定的周期，這樣很容易出現(xiàn)社會上相關(guān)專業(yè)人才供需不平衡的問題出現(xiàn)，直接會導(dǎo)致高校醫(yī)學(xué)教育管理常見問題的出現(xiàn)。

表6 稀釋劑的選擇

表6結(jié)果表明，含30%淀粉時顆粒顏色最好。

2.3.2 甜味劑加入量的考察 藥物提取物本身極苦，直接制劑必然影響患者口服時的口感，需要加入一定量甜味劑進行矯味。考慮到糖尿病患者的需求，擬選擇蛋白糖作為甜味劑。

取藥材提取物，粉碎后過80目篩，加入30%淀粉混合均勻，等比例分成5份，按表格中比例加入甜味劑，混合均勻，品嘗[11-15]。結(jié)果見表7。

表7 矯味劑的選擇

表7結(jié)果表明，5.0%時口感較好。

2.3.3 潤濕劑的考察 藥物提取物具有較大的粘性，不能用純水作為潤濕劑，因此考察不同濃度乙醇對制粒效果的影響。

取藥材提取物適量，粉碎后過80目篩，加入30%淀粉和5%蛋白糖混合均勻，等比例分成5份，分別加入不同濃度乙醇適量，制軟材，過30目篩制顆粒，觀察顆粒性質(zhì)[11-15]。結(jié)果見表8。

表8 潤濕劑的選擇

表8結(jié)果表明，用60%乙醇作為潤濕劑較為合適。2.4顆粒劑的小試放大 取藥材提取物約200 g，置濕法制粒機中，加30%淀粉和5%蛋白糖混合，加60%乙醇適量，制軟材，用搖擺式制粒機過30目篩制顆粒，用流化床干燥至顆粒水分小于3%，即得。

2.6 流動性的考察 采用固定圓錐槽法：取漏斗固定于水平放置的坐標紙上方適宜高度處，使漏斗下口距坐標紙的距離為H；取制備好的顆粒適量，沿漏斗壁緩慢倒入漏斗中，直到顆粒的圓錐體尖端接觸到漏斗口為止，此時由坐標紙測出圓錐體底部的半徑R，計算出休止角 (tgα=H/R)，重復(fù)測定3次[11-15]。

結(jié)果顆粒劑的平均休止角約為30°，證明自制顆粒劑流動性良好。

2.7 臨界相對濕度的測定 取顆粒約1 g，共7份，分別置已稱重的稱量瓶中，精密稱定，將稱量瓶瓶蓋打開，分別放入濕度表格中環(huán)境中，25℃恒溫放置24 h，取出，加蓋后精密稱定，計算吸濕百分率[11-15]。

表9 臨界相對濕度的考察結(jié)果

結(jié)果表明，顆粒劑在濕度超過58%之后吸濕性明顯增加，判斷顆粒劑的臨界相對濕度約為60%，因此在生產(chǎn)過程中環(huán)境濕度至少要低于60%。

3 討論

試驗中阿魏酸含量測定是在315 nm波長處進行的。根據(jù)文獻報道，阿魏酸在286 nm和215 nm處也有吸收，對此我們進行了波長掃描，結(jié)果顯示阿魏酸在315 nm處吸收值為最大。

顆粒劑是一種中間劑型，根據(jù)原處方生藥量折算，提取物服用量約為3.5 g，服藥量不算大，可以進一步將其制備成膠囊劑或者片劑，發(fā)揮其可以根據(jù)病情輕重增減藥量的優(yōu)勢。

本處方原工藝是將所有藥材經(jīng)水煎煮、濾過，濾液濃縮后經(jīng)相應(yīng)處理制備成大蜜丸給患者服用；經(jīng)前期藥理學(xué)實驗表明，部分藥材的醇提物與水提物混合后的混合物比全部藥材的水提物鎮(zhèn)痛作用強很多，證明原提取工藝無法提取出藥材中具有鎮(zhèn)痛效果的脂溶性成分，而現(xiàn)在的提取工藝更完整地保留了處方中的活性成分，更有利于藥學(xué)的發(fā)揮。

研究中是選用脂溶性和水溶性中最主要的活性成分的含量作為考核指標進行了提取工藝的篩選，但一個復(fù)方藥效的發(fā)揮不僅僅與這些主要活性成分有關(guān)系，具體與哪些成分的含量或者與哪些成分的組合有關(guān)，還需要進行深入細致的研究。

[1]趙鑫華.加味消炎止痛方的藥理作用及其機制的研究進展[J].中藥新藥與臨床藥理，2008，19(1)：77-79.

[2]張翠英，章洪，戚瓊?cè)A.川芎的有效成分及藥理研究進展[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014，41(10)：2264-2266.

[3]張煥，王一濤，嚴燦，等.當(dāng)歸與川芎藥理作用研究進展與比較[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（2）：293.

[4]張翠英，章烘，董宇，等.基于藥效成分丹酚酸B和阿魏酸在大鼠血漿的藥代動力學(xué)研究丹參與川芎配伍[J].中國中藥雜志，2015，40（8）：1589-1593.

[5]高秀艷，宋士軍，崔同，等.阿魏酸對大鼠離體胸主動脈環(huán)的舒張作用及其機制[J].鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2013，48（4）：459.

[6]潘明鳳.川芎的化學(xué)成分研究與多指標成分的含量測定[D].成都：西南交通大學(xué)，2014.

[7]馮敬騫，楊義芳.當(dāng)歸、川芎及其藥對的超臨界提取物的GC-MS成分分析[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2009，40（10）：754-757.

[8]呂光華，程世瓊，陳金泉，等.HPLC測定川芎藥材和飲片中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量及其質(zhì)量評價指標[J].中國中藥雜志，2010，35（2）：194-198.

[9]HPLC同時測定川芎、當(dāng)歸SFE-CO2萃取物中7種成分含量及阿魏酸松柏酯穩(wěn)定性考察[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2017，23（9）：24-29.

[10]項妤，張貴君，甘德全.HPLC測定CO2超臨界萃取的當(dāng)歸油藥效組分[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（6）：64-67.

[11]張荷蘭，陸鴻奎，王春光，等.復(fù)方翻白草顆粒劑的制備工藝研究[J].中國藥房，2016，27（10）：1392-1395.

[12]嚴云良，戴曉燕，吳巧鳳，等.4種中藥顆粒劑吸濕過程的數(shù)學(xué)模型應(yīng)用研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（11）：2963-2965.

[13]沈濤，李季文，梁海寧，等.多指標優(yōu)選益氣固本顆粒澄清工藝[J].中國藥房，2016，27（1）：76-79.

[14]文謹，劉起華.參柏顆粒兩種制粒工藝的比較研究[J].中成藥，2011，33（9）：1615-1617.

[15]張兆旺.中藥藥劑學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：394.

[16]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.