TRPV4受體對血管緊張素II誘導(dǎo)的小鼠腎損害的影響

閆鳳娜，劉素曉，崔 琳，謝世陽，沈 思，朱明軍，王幼平*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，中心實驗室，鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)科，鄭州 450008)

除糖尿病外，高血壓是導(dǎo)致腎損害的另一個最重要的危險因素[1]。筆者以往通過相關(guān)研究已經(jīng)證實以單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主要特征的炎癥反應(yīng)在高血壓所誘導(dǎo)的腎損害過程中發(fā)揮著重要作用[2]。瞬時受體電位香草酸亞型4(transient receptor potential vanilloid type 4，TRPV4)受體主要表達(dá)在心臟、血管內(nèi)皮以及腎等組織，它可以被多種物理因素(如：高溫和機(jī)械刺激)及化學(xué)因素(如：內(nèi)源性大麻素和花生四烯酸)等激活[3]。已有大量報道指出，TRPV4受體的活化可以增強多種炎癥反應(yīng)[4-5]。因此，本研究擬在血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)所誘導(dǎo)的高血壓小鼠模型上，通過利用TRPV4基因敲除(TRPV4-/-)小鼠探討TRPV4受體對該過程所誘導(dǎo)的腎損害的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性C57BL/6野生型小鼠32只，體重20～24 g，8～9周齡，購自北京維通利華動物有限公司[SCXK(京)2015-0011]。TRPV4-/-小鼠由美國密執(zhí)根州立大學(xué)提供，且其與C57BL/6小鼠回交6代以后所產(chǎn)生的雄性TRPV4-/-小鼠34只，體重20～24 g，8～9周齡。實驗在河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實驗室進(jìn)行[SYXK-00015172]，并且所有研究均遵循該醫(yī)院實驗動物倫理審查委員會相關(guān)規(guī)定(倫理審查編號：YFYDW2015012)。

1.2 主要試劑

Ang II(美國Sigma公司)；改良Jaffe肌酐測定試劑盒(美國BioAssay System 公司)；ELISA尿蛋白測定試劑盒(美國Exocell公司)；尿8-異構(gòu)前列腺素試劑盒(美國Cayman Chemical公司)；羥脯胺酸檢測試劑盒(美國Sigma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及造模

本實驗小鼠分為假手術(shù)組(野生型假手術(shù)組和TRPV4-/-型假手術(shù)組)和Ang II處理組(野生型Ang II處理組和TRPV4-/-型Ang II處理組)。根據(jù)以往研究報道的方法[6]，建立Ang II誘導(dǎo)的高血壓小鼠模型。具體操作如下：經(jīng)過1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)以后，經(jīng)皮下注射甲苯噻嗪(4 mg/kg)和氯胺酮(80 mg/kg)混合麻醉劑麻醉小鼠，且于頸背部皮下包埋miniosmotic pump(Alzet model 1004, Durect Corp, Cupertino, CA, 美國)后，分別連續(xù)灌注生理鹽水或Ang II(1 μg/kg·min)，共持續(xù)4周。假手術(shù)組小鼠灌注生理鹽水，Ang II處理組小鼠灌注Ang II。手術(shù)后，對所有小鼠連續(xù)3 d注射青霉素鈉鹽。本實驗共觀察4周。

1.3.2 動脈收縮壓的檢測

本研究利用Tail-cuff體積描記法測定手術(shù)前以及手術(shù)后各周各組小鼠的尾動脈收縮壓，具體操作方法如前所述[7]：上午10:00～12:00，取各組小鼠，待其安靜后，置于28℃～32℃溫箱內(nèi)加熱10 min，然后，采用固定器對其固定，利用BP-2000型血壓測定儀(購自美國Visitech System公司)連續(xù)測定小鼠尾動脈收縮壓5次，最后取5次測定的平均值作為動脈收縮壓值。

1.3.3 尿液及血液的分析

實驗處理開始后第26天，分別取各組實驗小鼠，置于代謝籠內(nèi)，收集其24 h 尿液，并稱體重。然后，對小鼠行皮下注射氯胺酮(80 mg/kg)和甲苯噻嗪(4 mg/kg)混合麻醉劑麻醉小鼠，經(jīng)腹主動脈采集血液，靜放后，于4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，收集血清后放置于-80℃冰箱中保存。分別采用特異性試劑盒測定尿液中8-異構(gòu)前列腺素的含量，ELISA試劑盒測定尿液白蛋白的含量，以及改良的Jaffe肌酐檢測試劑盒檢測血清中的肌酐濃度。

1.3.4 腎組織病理學(xué)分析

取各組小鼠右腎后，稱重，以4%的多聚甲醛對其進(jìn)行固定，石蠟包埋，并且制備為4 μm厚的組織切片。然后，分別采用過碘酸-雪夫反應(yīng)(PAS)與Masson三色法對組織切片進(jìn)行染色。為了保證實驗的客觀性，由一位不了解實驗設(shè)計的病理學(xué)人員，根據(jù)我們已報道的方法[8]，分別進(jìn)行腎小球硬化指數(shù)和腎小管間質(zhì)損傷分?jǐn)?shù)的半定量分析，從而評估腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損傷程度，具體方法如下：針對腎小球硬化指數(shù)，通過PAS染色，在×400倍條件下，每只小鼠隨機(jī)選取50個腎小球，根據(jù)腎小球硬化范圍進(jìn)行評分。0分：腎小球無硬化；1分：腎小球硬化范圍≤25%；2分：腎小球硬化范圍≤25%～50%；3分：腎小球硬化范圍≤50%～75%；4分：>75%。最后，腎小球硬化指數(shù)為腎小球分?jǐn)?shù)乘以該分?jǐn)?shù)所累積的腎小球百分率之和。針對腎小管間質(zhì)損傷分?jǐn)?shù)，通過Masson染色，在×200倍條件下，每只小鼠隨即選取20個視野，根據(jù)損傷范圍進(jìn)行評分。0分：無損害；0.5分：損害非常局限；1分：損害范圍<10%；2分：損害范圍為10%～25%；3分：損害范圍為25%～75%；4分：損害范圍>75%。最后，取平均值為腎小管間質(zhì)損傷分?jǐn)?shù)。

1.3.5 腎膠原含量分析

本研究采用羥脯胺酸測定試劑盒確定腎組織膠原水平的含量。腎樣本的處理如前所述[9]。采用比色法測定羥脯胺酸的含量，且制作羥脯胺酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算羥脯胺酸含量。本實驗假設(shè)羥脯胺酸占膠原蛋白平均含量的13.5%。最終實驗數(shù)據(jù)以每毫克干重中膠原的微克數(shù)表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血壓的變化

如圖1所示，實驗處理前各組小鼠之間基礎(chǔ)血壓并沒有明顯差異(WT sham group： 103±6 mmHg；TRPV4-/-sham group：107±7 mmHg；Ang II-treated WT group：107±6 mmHg； Ang II-treated TRPV4-/-group：101±6 mmHg；P> 0.05)。實驗處理后，野生型以及TRPV4-/-型假手術(shù)組小鼠的血壓平穩(wěn)，沒有發(fā)生明顯的改變。但是，經(jīng)過Ang II處理后的兩組小鼠從處理后第一周開始血壓便出現(xiàn)明顯升高(Ang II-treated WT group：153±5 mmHg；Ang II-treated TRPV4-/-group：147±5 mmHg)，與相應(yīng)的假手術(shù)組小鼠組比較(WT sham group：106±5 mmHg；TRPV4-/-sham group：103±5 mmHg)，其差異有顯著性(P< 0.05)，并且其于術(shù)后3、4周時達(dá)到峰值，然而，經(jīng)Ang II處理的野生型小鼠和TRPV4-/-小鼠血壓之間的差異無顯著性(3周：Ang II-treated WT group：164±6 mmHg vs. Ang II-treated TRPV4-/-group：170±6 mmHg；4周：Ang II-treated WT group：174±8 mmHg vs. Ang II-treated TRPV4-/-group：168±8 mmHg；P> 0.05)。

注：與野生型假手術(shù)組比較，*P< 0.05；與TRPV4-/-型假手術(shù)組比較，#P< 0.05。圖1 各組小鼠收縮壓的改變Note.*P< 0.05, compared with the WT sham group; #P< 0.05, compared with the TRPV4-/- sham group.Fig.1 Changes of systolic blood pressure in the groups

2.2 各組小鼠尿白蛋白、8-異構(gòu)前列腺素排泄量及血清肌酐的變化

如圖2所示，與相應(yīng)的假手術(shù)組比較(尿白蛋白：WT sham group：4.1±0.8 μg/24 h； TRPV4-/-sham group：4.8±1.1 μg/24 h；尿8-異構(gòu)前列腺素：WT sham group：0.35±0.25 ng/24 h；TRPV4-/-sham group：0.31±0.24 ng/24 h；血清肌酐：WT sham group：0.41±0.06 mg/dL；TRPV4-/-sham group：0.49±0.08 mg/dL)，經(jīng)Ang II處理的野生型和TRPV4-/-小鼠24 h尿白蛋白排泄量(Ang II-treated WT group：54.6±8.4 μg/24 h；Ang II-treated TRPV4-/-group：25.2±9.4 μg/24 h)以及尿8-異構(gòu)前列腺素的排泄量(Ang II-treated WT group：2.59±0.31 ng/24 h； Ang II-treated TRPV4-/-group：1.04±0.33 ng/24 h)均出現(xiàn)明顯增加(P< 0.05)，同時伴有血清肌酐明顯增加(Ang II-treated WT group：1.24±0.15 mg/dL；Ang II-treated TRPV4-/-group：0.88±0.14 mg/dL；P< 0.05)。然而，TRPV4基因敲除后，由 Ang II所誘發(fā)的上述改變受到明顯的抑制，其差異有顯著性(P< 0.05)。

注：與野生型假手術(shù)組比較，*P< 0.05；與TRPV4-/-型假手術(shù)組比較，#P< 0.05；與野生型Ang II處理組比較，?P< 0.05。圖2 各組小鼠尿白蛋白(A)、尿8-異構(gòu)前列腺素(B)以及血清肌酐(C)的變化Note.*P< 0.05, compared with the WT sham group.#P< 0.05, compared with the TRPV4-/- sham group.?P< 0.05, compared with the Ang II-treated WT group.Fig.2 Changes of urinary albumin (A), urinary 8-isoprostane (B) and serum creatinine (C) in the groups

2.3 各組小鼠腎臟組織病理學(xué)的變化

如圖3所示，與相應(yīng)的假手術(shù)組比較(WT sham group：0.08±0.05；TRPV4-/-sham group：0.12±0.07)，經(jīng)Ang II處理的野生型和TRPV4-/-小鼠腎小球均出現(xiàn)明顯的局灶性硬化，其硬化程度呈現(xiàn)顯著增高的現(xiàn)象(Ang II-treated WT group：1.78±0.29；Ang II-treated TRPV4-/-group：1.01±0.22；P< 0.05)，而TRPV4基因敲除能夠明顯抑制由Ang II所誘導(dǎo)的腎小球硬化現(xiàn)象(P< 0.05)。另外，如圖4所示，與相應(yīng)的假手術(shù)組比較(WT sham group：0.18±0.05；TRPV4-/-sham group：0.14±0.05)，經(jīng)Ang II處理的野生型和TRPV4-/-小鼠中腎小管出現(xiàn)明顯的肥厚、擴(kuò)張，以及間質(zhì)纖維化現(xiàn)象，其損傷程度明顯增加(Ang II-treated WT group：3.20±0.37；Ang II-treated TRPV4-/-group：1.96±0.32；P< 0.05)。但是，TRPV4基因敲除能夠明顯抑制由Ang II所誘導(dǎo)的上述腎小管間質(zhì)損傷現(xiàn)象(P< 0.05)。

2.4 各組小鼠腎膠原蛋白含量的變化

如圖5所示，與相應(yīng)的假手術(shù)組比較(WT sham group：6.37±1.32 μg/mg干組織；TRPV4-/-sham group：7.16±1.29 μg/mg干組織)，經(jīng)Ang II處理的野生型小鼠和TRPV4-/-小鼠腎膠原蛋白含量均有明顯的升高(Ang II-treated WT group：21.83±2.41 μg/mg干組織；Ang II-treated TRPV4-/-group：13.80±2.29 μg/mg干組織；P< 0.05)，而TRPV4基因敲除能夠顯著抑制上述由Ang II所引起的腎膠原蛋白水平的升高，其差異有顯著性(P< 0.05)。

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，皮下注射Ang II所誘導(dǎo)的高血壓能夠造成小鼠腎功能及腎病理學(xué)損害，上述損害主要表現(xiàn)為24 h 尿白蛋白與8-異構(gòu)前列腺素排泄量增加、血清肌酐升高，以及腎小球纖維樣硬化與腎小管間質(zhì)損傷程度加重、腎膠原蛋白沉積等多個方面。但是，TRPV4基因敲除能夠明顯抑制上述由Ang II所誘發(fā)的腎損傷。因此，上述研究結(jié)果提示激活TRPV4受體能夠促進(jìn)Ang II所誘導(dǎo)的腎損害。

注：A：各組小鼠腎PAS染色(×400)；a：野生型假手術(shù)組；b：TRPV4-/-型假手術(shù)組；c：野生型Ang II處理組；d：TRPV4-/-型Ang II處理組。B：各組小鼠腎小球硬化指數(shù)變化；與野生型假手術(shù)組比較，*P< 0.05；與TRPV4-/-型假手術(shù)組比較，#P< 0.05；與野生型Ang II處理組比較，?P< 0.05。圖3 各組小鼠腎臟中腎小球硬化程度的變化Note.A: Representative PAS-stained kidney sections in the all groups (×400). a: WT sham group. b: TRPV4-/- sham group. c: Ang II-treated WT grou. d: Ang II-treated TRPV4-/- group. B: Changes in glomerulosclerosis index in all groups. *P< 0.05, compared with the WT sham group.#P< 0.05, compared with the TRPV4-/- Sham group.?P< 0.05, compared with the Ang II-treated WT group.Fig.3 Glomerulosclerotic changes in the groups

注：A：各組小鼠腎Masson染色(×200)；a：野生型假手術(shù)組；b：TRPV4-/-型假手術(shù)組；c：野生型Ang II處理組；d：TRPV4-/-型Ang II處理組；B：各組小鼠腎小管間質(zhì)損傷分?jǐn)?shù)變化；與野生型假手術(shù)組比較，*P< 0.05；與TRPV4-/-型假手術(shù)組比較，#P< 0.05；與野生型Ang II處理組比較，?P< 0.05。圖4 各組小鼠腎中腎小管間質(zhì)損傷程度的變化Note.A: Representative Masson trichrome-stained kidney sections in the groups (×200). a: WT sham group. b: TRPV4-/- sham group. c: Ang II-treated WT group. d: Ang II-treated TRPV4-/- group. B: Changes of tubulointerstitial injury scores in the groups. *P< 0.05, compared with the WT sham group. #P< 0.05, compared with the TRPV4-/- sham group. ?P< 0.05, compared with the Ang II-treated WT group.Fig.4 Changes of tubulointerstitial injury in the groups

注：與野生型假手術(shù)組比較，*P< 0.05；與TRPV4-/-型假手術(shù)組比較，#P< 0.05；與野生型Ang II處理組比較，?P< 0.05。圖5 各組小鼠腎臟膠原蛋白含量的變化Note.*P< 0.05, compared with WT sham group. #P< 0.05, compared with the TRPV4-/- sham group. ?P< 0.05, compared with the Ang II-treated WT group.Fig.5 Changes of collagen levels in kidneys in the groups

我們知道，血壓升高是造成腎損害的主要機(jī)制之一[10]。通過對小鼠尾動脈收縮壓的檢測及分析，我們發(fā)現(xiàn)皮下注射Ang II能夠在小鼠誘發(fā)高血壓，而TRPV4基因敲除可以減輕和緩解由高血壓所誘導(dǎo)的腎損害。但是，TRPV4基因的敲除并不影響Ang II所誘發(fā)的高血壓。因此，我們推測，在Ang II所誘發(fā)的腎損害過程中，TRPV4基因敲除所表現(xiàn)出的腎保護(hù)作用并不是通過降低血壓來實現(xiàn)的，即TRPV4受體促進(jìn)Ang II所誘導(dǎo)的腎損害的機(jī)制是獨立于血壓因素的。

眾所周知，尿白蛋白是反映腎疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)皮下注射Ang II能夠在小鼠中造成明顯的白蛋白尿。然而，我們通過光學(xué)顯微鏡證實腎小球的損害程度并非與尿白蛋白相一致，這與以往的報道相一致[11]，即尿白蛋白的增加先于光學(xué)顯微鏡下腎損害的發(fā)生，這是由于導(dǎo)致白蛋白尿的腎超微結(jié)構(gòu)的改變先于光學(xué)顯微鏡下腎組織形態(tài)學(xué)的改變[12]。TRPV4基因敲除對于由Ang II引起的尿白蛋白有顯著的抑制作用，然而，TRPV4受體對Ang II所誘發(fā)的腎超微結(jié)構(gòu)損傷的影響還有待于進(jìn)一步研究闡明。

目前，盡管高血壓造成腎損害的具體機(jī)制尚不清楚，但是，大量研究已證實氧化應(yīng)激反應(yīng)在此過程中發(fā)揮著重要作用[13,14]。在高血壓的發(fā)生和發(fā)展過程中，活性氧(reactive oxygen stress, ROS)的增加可導(dǎo)致腎發(fā)生炎癥反應(yīng)和相關(guān)損害。在病理狀態(tài)下，ROS可以氧化多種細(xì)胞成分，其中包括細(xì)胞膜和DNA等，從而給機(jī)體組織帶來損傷。8-異構(gòu)前列腺素作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)物，其水平通常用來反映氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度。本研究結(jié)果顯示，在Ang II造成腎損害的過程中，尿中8-異構(gòu)前列腺素的排泄量顯著增加，從而反映出腎氧自由基水平的增高。另外，TRPV4基因敲除后，上述反應(yīng)顯著減弱，該研究結(jié)果提示TRPV4受體通過促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇Ang II所誘導(dǎo)的腎損害。

TRPV4受體主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，它的活化可以增強以單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)[3]。腎損害的發(fā)展過程可以表現(xiàn)在多個方面，其中包括腎小管間質(zhì)中炎性細(xì)胞的浸潤和膠原蛋白的沉積等[15]，該病理過程引起腎纖維化，最終導(dǎo)致腎衰竭。為了探討TRPV4受體在腎損害中的作用，我們檢測了腎膠原蛋白的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TRPV4基因敲除小鼠，由皮下灌注Ang II所導(dǎo)致的腎膠原沉積水平的增高程度較野生型小鼠明顯下降，該結(jié)果表明TRPV4受體可以明顯促進(jìn)腎纖維化，而該病理變化最終可引起腎的嚴(yán)重?fù)p傷。

本實驗研究結(jié)果顯示，通過皮下注射Ang II可以誘發(fā)明顯的腎損傷，而在此過程中，TRPV4受體發(fā)揮著重要作用。在Ang II所誘導(dǎo)的高血壓過程中，TRPV4受體通過增加氧自由基的產(chǎn)生促進(jìn)腎損害的發(fā)生和發(fā)展。因此，針對高血壓所誘導(dǎo)的腎損害，我們的研究結(jié)果提示TRPV4受體可能成為防治該損害的重要分子生物學(xué)靶點。

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