維生素D缺乏對自發性糖尿病大鼠發病的影響

李艷艷，王 寧，劉妍妍，于 微，劉 濤，郝麗萍，王 俊*

(1.深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518020； 2.華中科技大學同濟醫學院公共衛生學院營養與食品衛生學系，武漢 430030)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T 2DM)是當前嚴重威脅人類健康的世界性公共衛生問題。據國際糖尿病聯盟(IDF)統計，全球有4.15億糖尿病患者，其中90%以上為T 2DM，我國的形勢更為嚴峻，帶來沉重的疾病與經濟負擔[1]。維生素D(VD)是一種脂溶性維生素，通過與維生素D受體(VDR)結合發揮多種生物學效應。研究發現VD不僅在調節鈣磷代謝及維持骨穩態方面發揮重要作用，而且參與糖脂代謝，維持正常的胰島β細胞功能與胰島素敏感性[2-3]。人群研究表明，肥胖及T 2DM患者普遍存在VD缺乏，VD缺乏已作為重要的影響因子成為T 2DM近年來研究的熱點。

T 2DM發病機制異常復雜，動物模型在T 2DM機制的研究中發揮著重要的作用。Zucker糖尿病肥胖大鼠(Zucker diabetic fatty rat，ZDF)是從出現糖尿病表型的Zucker大鼠中篩選并近親雜交培育出的一種自發性T 2DM模型鼠[4]，ZDF大鼠經高血脂高血糖、糖耐量異常、胰島素抵抗等程序化發展為T 2DM，與人類T 2DM發病進程相似，被認為是T 2DM研究的理想模型[5-6]。建立VD缺乏ZDF大鼠T 2DM模型有利于深入探討VD在肥胖型糖尿病發病進程中的作用及相關機制。VD缺乏對ZDF大鼠糖尿病的發病是否有重要的影響目前尚不清楚，因此，本研究去除ZDF大鼠專用飼料Purina #5008中添加的VD，建立VD缺乏ZDF大鼠T 2DM模型，與正常飼料喂養的ZDF大鼠作比較，探討VD缺乏狀態下ZDF大鼠T 2DM的發病特點及VD缺乏對ZDF大鼠糖尿病發病的影響，對于研究VD在T 2DM防治中的作用具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性自發性肥胖型2型糖尿病大鼠(zucker diabetic fatty rat，ZDF)20只，體重(125.8±11.7)g，5～6周齡；Zucker瘦型大鼠(zucker lean，ZL)20只，體重(113.9±6.6)g，5～6周齡，購于維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2012-0001]，動物飼養于華中科技大學實驗動物中心[SYXK(鄂)2016-0057]，通過華中科技大學同濟醫學院實驗動物醫學倫理委員會審批(IACUC Number: 432)。

1.2 主要試劑及儀器

羅氏卓越型血糖儀；血糖試紙；尿糖試紙(高爾寶)；葡萄糖測定試劑盒(北京中生北控科技股份有限公司)；蘇木素、伊紅(北京索萊寶公司)；二甲苯；梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)；倒置顯微鏡(奧林巴斯)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

適應性喂養1周后，瘦型及胖型鼠按照體重隨機分共分為4組：瘦型鼠體重為104～127 g，分為104～110、110～115、116～120、120～127 g 四個等級，每個等級大鼠隨機分為2組即正常對照組(ZL)、VD缺乏對照組(ZL+VD.Def)；胖型鼠體重為105～152 g，分為105～110、111～120、121～130、130～140、141～152 g五個等級，然后將每個等級的大鼠隨機分為2組即：模型組(ZDF)、VD缺乏模型組(ZDF+VD.Def)。喂養Zucker大鼠專用飼料Purina #5008(營養成分見表1，北京科奧協力飼料有限公司提供)，VD 缺乏組飼料是在原飼料配方基礎上去除添加的VD。各組大鼠喂養至12周齡，喂養期間，記錄每天進食量，每周測量一次體重、記錄飲水量及收集24 h尿樣并監測尿糖，每兩周監測空腹血糖。

1.3.2 大鼠能量利用率

能量利用率(g/kcal)=[末期體重 - 初始體重(g)]/同期熱能攝入量(kcal)×100 %。

同期熱能攝入量(kcal)=喂養期間大鼠的進食總量(g)× Purina #5008飼料的能量(4.15 kcal/g)。

1.3.3 飲水量、尿量及尿糖監測

各組大鼠每周在代謝籠中喂養2 d，記錄每只大鼠飲水量，收集24 h尿樣，并用尿糖試紙監測是否出現尿糖。

1.3.4 血糖檢測及糖耐量試驗

每兩周測定各組大鼠空腹血糖(隔夜禁食10 h)；于11周齡進行口服糖耐量(OGTT)實驗：各組大鼠隔夜禁食10 h，測定空腹血糖后，根據體重灌胃葡萄糖(1 g/kg)，并于30、60、90、120 min監測血糖變化，繪制血糖變化曲線，計算曲線下面積(AUC)。

1.3.5 胰腺HE染色

大鼠處死后，迅速分離胰腺，胰腺相同部位組織于4% 多聚甲醛固定24 h后制備石蠟切片。石蠟切片經過二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，蘇木素、伊紅染色，脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照(×400)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 VD缺乏對ZDF大鼠體重及能量利用率的影響

如表2所示：喂養結束時，T 2DM模型組(ZDF)體重顯著高于正常對照組(ZL)，VD缺乏模型組(ZDF+VD.Def)大鼠體重顯著高于ZDF組，有趣的是，VD缺乏對照組(ZL+ VD.Def)大鼠體重較ZL組明顯增加。此外，VD缺乏組大鼠能量利用率相對較高但無統計學差異，說明膳食中VD缺乏可能會加快ZDF大鼠體重的增加。

表1 Purina #5008 飼料營養成分表

表2 ZDF大鼠體重增長及能量利用率

注：與ZL組比較，aP< 0.05；與ZL+VD.Def組比較，bP< 0.05；與ZDF組比較，cP< 0.05。

Note.Compared with the ZL group，aP< 0.05. Compared with the ZL+VD.Def group，bP< 0.05. Compared with the ZDF group，cP< 0.05.

2.2 VD缺乏對ZDF大鼠飲水量、尿量及尿糖的影響

注：與ZL組比較，aP< 0.05；與ZL+VD.Def組比較，bP< 0.05；與ZDF組比較，cP< 0.05。圖1 各組大鼠隨周齡飲水量及尿量的變化情況Note.Compared with the ZL group, aP< 0.05. Compared with the ZL+VD.Def group, bP< 0.05. Compared with the ZDF group, cP< 0.05.Fig.1 Water intake and urine volume in the ZDF rats

飼養過程中，各組大鼠每周進代謝籠中一次，記錄其飲水量、收集24 h尿樣及檢測尿糖。如圖1所示，自10周齡開始，VD缺乏模型組(ZDF+VD.Def)大鼠飲水量及尿量迅速增加，而ZDF組則在11周齡才開始顯著增高，并且遠低于ZDF+VD.Def組。到12周齡，ZDF+VD.Def組飲水量為ZDF組的2.1倍，尿量為ZDF組的3.0倍，說明VD缺乏加快并加重了ZDF大鼠“多飲多尿”的狀況。隨著尿量的增加，自8周齡開始，ZDF+VD.Def組大鼠開始出現尿糖，伴隨著尿量的增加，尿糖愈加嚴重。ZDF組大鼠自10周齡出現尿糖，但其尿糖含量大大低于ZDF+VD.Def組(尿糖檢測由尿糖試紙測定，根據顏色深淺判定，結果未在文中顯示)。VD缺乏對對照組大鼠的飲水量、尿量及尿糖沒有影響。

2.3 VD缺乏對ZDF大鼠血糖變化的影響

飼養過程中，每兩周監測各組大鼠的空腹血糖(禁食10 h)。由圖2所示，ZL和ZL+VD.Def兩對照組大鼠自始至終血糖沒有明顯的變化，與對照組相比，ZDF組大鼠自10周齡血糖明顯升高，而ZL+VD.Def組大鼠自8周齡開始血糖明顯升高，并隨大鼠周齡的增加而大幅增高，12周齡時，ZL+VD.Def組大鼠空腹血糖達到19.5 mmol/L，約為ZDF組大鼠的2.0倍。

2.4 VD缺乏對ZDF大鼠口服糖耐量的影響

各組大鼠于11周齡進行口服糖耐量(OGTT)實驗，以評估糖耐量受損情況。各組大鼠禁食10 h，測定空腹血糖后，根據體重灌胃葡萄糖(1 g/kg)，并于30、60、90、120 min監測血糖變化。如圖3所示，各組大鼠血糖在口服葡萄糖30 min時達到峰值，ZL、ZL+VD.Def、ZDF組大鼠血糖在60 min開始下降，120 min時恢復在初始血糖水平，而ZDF+VD.Def組大鼠血糖在60 min時依然處于高值，90 min才有所降低。ZDF+VD.Def組曲線下面積(AUC)明顯高于ZDF組，約為2.0倍，說明VD缺乏加重了ZDF大鼠糖耐量受損。

2.5 VD缺乏對ZDF大鼠胰腺損傷的影響

如圖4所示，ZL及 ZL+VD.Def組大鼠胰腺外分泌腺與胰島之間邊界清楚，胰島形態完整規則，胰島內細胞數較多，排列緊密，分布均勻；核圓形、胞漿豐富、結構清楚，無變性壞死；ZDF組大鼠胰腺外分泌腺與胰島之間邊界尚清楚，部分細胞出現腫脹、變性，與ZDF相比，ZDF+VD.Def組大鼠胰腺外分泌腺與胰島之間邊界模糊，胰島形態極不規則、胰島β細胞排列紊亂，細胞腫脹、胞核呈溶解狀，胞質疏松淡染。

3 討論

注：與ZL組比較，aP< 0.05；與ZL+VD.Def組比較，bP< 0.05；與ZDF組比較，cP< 0.05。圖2 各組大鼠血糖隨周齡的變化情況Note.Compared with the ZL group，aP< 0.05. Compared with the ZL+VD.Def group, bP< 0.05. Compared with the ZDF group, cP< 0.05.Fig.2 Changes of serum glucose with age of the ZDF rats

注：與ZL組比較，aP< 0.05；與ZL+VD.Def組比較，bP< 0.05；與ZDF組比較，cP< 0.05。圖3 各組大鼠口服糖耐量Note.Compared with the ZL group，aP< 0.05. Compared with the ZL+VD.Def group, bP< 0.05. Compared with the ZDF group, cP< 0.05.Fig.3 Glucose tolerance of the ZDF rats in each group

圖4 各組大鼠胰腺HE染色(×400)Fig.4 The pancreatic islet structures of the ZDF rats in each group

流行病學調查發現，目前全球近10億人處于VD缺乏或者不足狀態[7]。VD缺乏不僅增加佝僂病及骨折風險，還與肥胖、糖尿病等疾病的發生密切相關[8]。我們的實驗發現，VD缺乏會加快Zucker大鼠體重的增長，這可能與VD缺乏影響脂代謝有關。許多研究表明，體內VD的水平與肥胖程度呈負相關。Robinson等[9]人發現，VD缺乏會增加兒童肥胖風險。Gonzalez-Molero等[10]對1226名志愿者進行為期11年的隊列研究發現，低VD水平與肥胖及未來發生肥胖的風險密切相關。有趣的是，本研究中VD缺乏也會引起正常對照組大鼠體重的增加、能量利用率提高，相關的機制仍未闡明，需要進一步深入研究。

越來越多的研究證明，VD缺乏會增加糖尿病的發病風險[11-12]。一項對9841名受試者進行的為期29年的隨訪，矯正年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI、血脂等危險因素后，發現最低水平的VD與最高水平VD人群發生糖尿病的風險比值為1.22，表明血清低VD水平是發生T 2DM的重要危險因素[13]。與以往的研究一致，本實驗中，與正常Purina #5008飼料喂養相比，飼料中VD缺乏會導致ZDF大鼠“多飲多尿”癥狀提前出現，血糖尿糖顯著升高，糖耐量受損更為嚴重，而VD缺乏對對照鼠(ZL)的糖代謝沒有明顯的影響，這些結果表明VD缺乏加快并加重了ZDF大鼠T 2DM病情發展，VD缺乏可能是肥胖型T 2DM發生發展的關鍵因素。

本實驗采用ZDF大鼠為實驗對象，該大鼠是由于瘦素受體突變使得瘦素對食欲控制及產熱作用受損，導致多食、肥胖，表現為糖耐量異常、高脂血癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗等特點[14-16]。研究發現，在肥胖及糖尿病人群中瘦素抵抗普遍存在[17]，ZDF大鼠病情的發展復制了人類T 2DM的進程[18]。我們的研究結果提示，VD缺乏影響ZDF大鼠的糖脂代謝導致肥胖及糖尿病的發生或不僅僅依賴瘦素受體途徑，潛在的通路需要進一步研究加以證實。

T 2DM胰島β細胞損傷是造成功能受損的主要原因，最終引起血糖控制失調。VDR存在胰島β細胞內，VD經肝臟、腎臟轉化成活性形式 1, 25(OH)2VD3后與VDR結合，維持正常的胰島β細胞功能及胰島素敏感性。有研究表明，糖尿病小鼠模型中，VD缺乏可導致胰島功能受損、抑制胰島素的分泌[19-20]。VD可通過上調或下調β細胞內的VDR數量和維生素D依賴性鈣結合蛋白(DBP)水平，從而促進胰島β細胞合成與分泌胰島素。此外，VD可通過調控細胞因子的作用保護胰島β細胞[21]。本研究中，VD缺乏飼料喂養的ZDF大鼠胰島損傷更為嚴重，胰島β細胞腫脹、空泡化病變，細胞核溶解，表明VD缺乏會加重肥胖型T 2DM胰島β細胞結構破壞，功能受損，相關的機制需要進一步深入研究。

綜上所述，本研究成功建立了VD缺乏的ZDF大鼠T 2DM模型，并發現VD缺乏加快并加重T 2DM的病情，VD缺乏是肥胖型T 2DM發病的關鍵因素，相關的機制正在運用代謝組學及蛋白組學的技術進行深入的研究。本實驗為VD缺乏與糖尿病的關系及相關機制的研究提供了良好的動物模型，對于探討VD在T 2DM的防治中的作用具有重要的意義。

致謝：感謝華中科技大學同濟醫學院的老師和同學在動物飼養中給予的幫助，感謝科室領導、同事對實驗的支持與付出。

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