飛龍掌血提取物對高脂血癥心肌缺血大鼠炎癥因子的影響

劉 明，劉 楊，鄧 穎，胡祖林

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550025； 2.國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽 550002)

據(jù)統(tǒng)計，心血管疾病已經(jīng)成為一個世界性的影響社會各經(jīng)濟(jì)群體的健康問題，2015年全球約有1792萬人死于心血管疾病[1]。動脈粥樣硬化是心血管疾病的根本原因，脂質(zhì)代謝異常是動脈粥樣硬化最重要的危險因素[2]。大量研究表明，炎癥因子(TNF-α、IL-6等)在高脂血癥和心血管疾病的發(fā)展中起到重要的誘導(dǎo)作用，調(diào)控炎癥反應(yīng)是心血管疾病治療的一種可靠、有效的手段[3-4]。

飛龍掌血為蕓香科植物飛龍掌血ToddaliaasiaticaLam.的根或根皮，為貴州苗族習(xí)用藥材[5]。藥理研究表明其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗病毒、保護(hù)心肌等作用[6-7]。因此，飛龍掌血顯示潛在的對心血管疾病的治療作用。本研究利用高脂血癥復(fù)合心肌缺血大鼠模型，觀察飛龍掌血對高脂血癥心肌缺血大鼠血脂和炎癥因子的影響，并分析可能的機(jī)制，為進(jìn)一步應(yīng)用飛龍掌血治療心血管疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體重(200±20)g，8周齡，購自中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心[SCXK(軍)2014-0011]。動物飼養(yǎng)于貴州省實驗動物工程技術(shù)中心[SYXK(黔)2012-0001]，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(23±1)℃和濕度(55±2)%，自由進(jìn)食，每日光照/黑暗各12 h，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(編號1509005)。

1.2 實驗藥物和試劑

飛龍掌血提取物(TAE)是由飛龍掌血根皮提取獲得(飛龍掌血根皮購自貴陽市藥材市場，加8倍70%乙醇回流提取2次，濾液經(jīng)水沉淀后，濃縮干燥，提取率為10%)，臨床人日用生藥量為10～30 g，本研究依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果擬定人日用生藥量為12 g，折算為提取物為1.2 g；辛伐他汀片(每片10 mg)，山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司；鹽酸異丙腎上腺素注射液(1 mg/mL)，上海禾豐制藥有限公司；TC、TG、LDL、HDL試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所；TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-10試劑盒，均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實驗儀器

MS-200生物信號記錄儀，成都泰盟科技有限公司；TGL-12 GB-C臺式高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；721分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；ZS-3型酶標(biāo)儀，北京新風(fēng)機(jī)電廠；RM2015石蠟切片機(jī)，德國萊卡；BX51T-PHD-J11顯微鏡，日本奧林巴斯。

1.4 實驗方法

1.4.1 高脂血癥大鼠模型建立及分組、給藥

參照文獻(xiàn)方法[8-9]造模：高脂血癥組大鼠每天以高脂飼料(組成: 3.5%膽固醇、10%豬油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5%白糖、80.8%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)，空白組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，4周后對照組與高脂血癥組隨機(jī)取3只大鼠檢測血脂4項，高脂血癥組血脂指標(biāo)與空白組相比較具有明顯區(qū)別，則說明模型制備成功。

選取體重相近的造模動物繼續(xù)喂飼高脂飼料，并隨機(jī)分成模型組(model)、辛伐他汀組(SVTT，3.5 mg/kg)，飛龍掌血提取物高、低劑量組(TAE，280、70 mg/kg)及對照組(control)，每組10只。灌胃給予相應(yīng)的藥物，10 mL/kg，每天一次，連續(xù)4周，對照組與模型組灌胃等容積蒸餾水。

1.4.2 心肌缺血模型建立

參照文獻(xiàn)方法[6,10-11]造模：于末次給藥前72 h，除對照組外，于灌胃給藥30 min后，各組動物皮下注射Iso 4 mg/kg，對照組給予等容量的生理鹽水，連續(xù)3次，每間隔24 h，誘發(fā)冠狀動脈痙攣心肌缺血。

1.4.3 觀察指標(biāo)及檢測

第3次皮下注射Iso前，大鼠用1%戊巴比妥鈉3 mL/kg腹腔注射麻醉，與MS-200生物信號記錄儀相連，先描記一段注射Iso前的心電圖，然后皮下注射Iso，記錄30 min的Ⅱ?qū)?lián)心電圖。主要觀察陽性標(biāo)準(zhǔn)T波和ST段，參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[11]，具備以下條件之一者即可判斷為心肌缺血陽性，①心電圖ST段水平上抬或向下偏移>0.1 mV；②T波高聳超過同導(dǎo)聯(lián)R波的1/2及以上者。每間隔10 min記錄一次大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖，共記錄30 min，分別測量Ⅱ?qū)?lián)在各時刻ST段偏移的幅度，計算各組Ⅱ?qū)?lián)注射Iso前與注射Iso后各時刻ST段偏移幅度的差值△ST(mV)。

上述檢測完成后，腹主動脈取血，3500 r/min離心15 min，取上清液，每組隨機(jī)選取8個樣本按照試劑盒說明書操作，檢測血清TC、TG、LDL、HDL、TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-10含量。

取心臟、肝臟，生理鹽水清洗，濾紙吸干水，稱重；剝離生殖器及腎周圍的脂肪，稱取脂肪的重量，計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)(g/100 g)=臟器重÷體重×100。

每組隨機(jī)取6只動物心臟，4%多聚甲醛固定，進(jìn)行切片制作，HE染色，顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 心電圖變化

模型組大鼠S-T段缺血改變明顯，各時刻ST段偏移幅度的差值顯著增加；與模型組相比，TAE高、低劑量組均能明顯改善大鼠心肌缺血變化，各時刻ST段偏移幅度的差值顯著下降(P< 0.05)。如表1、圖1所示。

2.2 臟器指數(shù)的變化

結(jié)果顯示模型組大鼠的臟器指數(shù)顯著升高；與模型組相比，TAE高、低劑量組能顯著降低心臟指數(shù)、脂肪指數(shù)，TAE高劑量組能明顯降低肝臟指數(shù)(P< 0.05)。如表2所示。

2.3 血脂水平的變化

模型組大鼠血清TC、TG、LDL含量顯著升高，血清HDL含量明顯降低；與模型組相比，TAE高、低劑量組能顯著降低血清TC、TG、LDL含量，TAE高劑量組能升高血清HDL含量(P< 0.05)。如表3所示。

2.4 炎癥因子的變化

模型組大鼠血清TNF-α、INF-γ、IL-6含量顯著升高，血清IL-10含量明顯降低；與模型組相比，TAE高、低劑量組能顯著降低血清TNF-α、INF-γ、IL-6含量，TAE高、低劑量組能升高血清IL-10含量(P< 0.05)。如表4所示。

表1 對模型大鼠心電圖的影響

注：與模型組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the model group，*P< 0.05，**P< 0.01.

圖1 對模型大鼠心電圖的影響Fig.1 Effects of TAE on electrocardiogram of the model rats

組別Groups劑量(mg/kg)Doses心臟指數(shù)Heartindex肝臟指數(shù)Liverindex脂肪指數(shù)Fatindex對照組Controlgroup—0.371±0.069**3.032±0.391**1.742±0.171**模型組Modelgroup—0.499±0.0764.169±0.4282.640±0.141辛伐他汀組SVTT3.50.423±0.059*3.817±0.373*1.909±0.176**飛龍掌血組TAE2800.418±0.075*3.784±0.445*1.999±0.192**700.426±0.069*3.921±0.4462.246±0.178**

注：與模型組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表3 對模型大鼠血清TC，TG，LDL，HDL含量的影響

注：與模型組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the model group，*P< 0.05，**P< 0.01.

表4 對模型大鼠血清TNF-α，INF-γ，IL-6，IL-10含量的影響

注：與模型組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01.

圖2 對模型大鼠心肌組織病理形態(tài)的影響(HE×100)Fig.2 Effects of TAE on the pathological changes of myocardial tissue in the model rats. HE staining.

2.5 心肌組織病理變化

對照組大鼠的心肌組織結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維排列整齊，沒有變性、壞死、肥大、萎縮的病變。模型組大鼠注射Iso后，引起了心肌損傷，有大片壞死灶，肌纖維排列紊亂、壞死細(xì)胞質(zhì)溶解以及水腫。與模型組相比，TAE高、低劑量組大鼠心肌組織病變的程度明顯減輕。如圖2所示。

3 討論

在制備高脂血癥動物模型中，給動物喂飼高脂飼料是最為常用的方法。盡管高脂飼料造模存在諸如飼料過于油膩而影響動物的進(jìn)食，飼料損耗大，成本較高，且油脂對整個實驗環(huán)境也造成一定的污染等缺點，但長期高脂飲食制備高脂血癥是最符合人類高脂血癥形成特點，因此，高脂飼料制備高脂血癥動物模型依然是目前實驗研究中最常用的造模方法。本研究結(jié)果表明，給大鼠進(jìn)行高脂飼料喂飼4周，即可形成高脂血癥，繼續(xù)喂飼高脂飼料致8周時，大鼠血清TC、TG、LDL含量顯著升高，血清HDL水平明顯下降，肝臟、脂肪指數(shù)顯著升高，經(jīng)飛龍掌血治療后，血清TC、TG、LDL含量明顯降低，血清HDL水平顯著升高，肝臟、脂肪指數(shù)明顯下降，表明飛龍掌血對高脂飼料引發(fā)的大鼠高脂血癥具有顯著的抑制作用。

近年研究發(fā)現(xiàn)，90% 以上的缺血性心臟病是由于冠狀動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)引起的，高脂血癥是AS的重要促進(jìn)因素[12]。隨著AS炎癥學(xué)說的提出，人們逐漸認(rèn)識到冠心病心肌缺血是一個炎癥性疾病過程，炎癥被認(rèn)為是AS的核心發(fā)病機(jī)制，參與了AS從發(fā)生到發(fā)展以及惡化的所有病理過程[13]。大量臨床觀察也都證明炎癥因子水平與高脂血癥有著密切的聯(lián)系[14]。因此，通過降血脂及抗炎性損傷預(yù)防和治療心血管疾病已經(jīng)成為目前的研究熱點。大量研究表明，高脂血癥產(chǎn)生的大量脂肪細(xì)胞可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化，進(jìn)而分泌炎癥因子如IL-6，引起高TG血癥，造成潛在的心血管疾病風(fēng)險；脂肪細(xì)胞也可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的活化，進(jìn)而分泌炎癥因子如INF-γ，分泌的INF-γ可進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化，分泌IL-1β，并聯(lián)合IL-1β共同刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-6，加重炎癥反應(yīng)和高脂血癥心肌損傷，形成惡性循環(huán)[15]。另一方面，活化的T淋巴細(xì)胞會調(diào)節(jié)IL-10等的分泌，抑制IL-6的生理活性，減輕炎癥反應(yīng)，達(dá)到動態(tài)平衡[16]。本研究結(jié)果顯示，飛龍掌血對高脂血癥心肌缺血大鼠具有保護(hù)作用，表現(xiàn)為大鼠心臟指數(shù)顯著降低，明顯改善心電圖S-T段，降低血清TNF-α、INF-γ、IL-6水平，升高血清IL-10水平，改善心肌組織病理損傷，說明飛龍掌血通過調(diào)節(jié)抗炎與促炎因子的平衡，減輕心肌缺血損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞。

本研究對飛龍掌血提取物降血脂、抗心肌缺血和抗炎性損傷的作用機(jī)制做了初步的探討，發(fā)現(xiàn)飛龍掌血提取物可有效降低高血脂和改善心肌缺血損傷，調(diào)節(jié)抗炎與促炎因子平衡，為進(jìn)一步開發(fā)利用飛龍掌血植物資源和研制新藥提供了實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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