大鼠Pig-a基因突變試驗中N-乙基-N-亞硝基脲和環磷酰胺量-效關系的優化

劉香梅，李培寧，劉冬虹，黃宇鋒，龐增雄，陳梓靈，徐穎愉，丘智峰

(廣州質量監督檢測研究院，廣州 511447)

Pig-a基因位于X染色體上，作為管家基因，其同源基因編碼區的結構和功能在人、大鼠、小鼠都有高度的保守性，該基因位點的突變可間接導致細胞表面錨蛋白(GPI-AP)的缺失，如CD59、CD55等，提示我們Pig-a基因突變試驗可用于檢測體內基因突變終點遺傳毒性試驗。

目前，常用的遺傳毒性試驗陽性物，如乙基亞硝基脲(ethylnitrosourea，ENU)、4-硝基喹啉-N-氧化物(4NQO)，環磷酰胺(cyclophosphamide, CP)，苯并芘等也可作為Pig-a基因突變試驗陽性物開展試驗[1-3]，但是致突變的效果不同。研究發現，多能干細胞及成熟的血細胞均可發生Pig-a基因突變而導致的GPI-AP缺失，因此外周血是最早用于研究Pig-a基因突變，而外周血中不同細胞的受累程度不同，紅細胞較少發生GPI-AP的自發缺失，因此可以將外周血紅細胞表面CD59缺失率作為Pig-a基因體內突變試驗檢測終點[4]。傳統遺傳毒性試驗具有周期長、成本較高、且大多不能有效反映基因突變終點，從而造成其體外和體內試驗結果的一致性也欠佳等缺陷，而利用Pig-a基因突變試驗原理建立的致突變檢測方法則可以解決這些問題。

本試驗研究不同劑量的ENU和CP對SD大鼠外周血紅細胞表面錨蛋白CD59缺失的影響，從而篩選適合于遺傳毒性試驗的優選陽性物及劑量，確定實驗周期，以優化Pig-a基因突變試驗檢測方法，用于化妝品致突變性安全評價。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，雄性24只，180～200 g，40～50日齡，購自南方醫科大學實驗動物中心[SCXK(粵)2016-0041]，倫理審查編號：2017-01-07。大鼠飼養于本單位屏障實驗室[SYXK(粵)2014-0137]，自由進食進水，實驗室溫度20℃～26℃，濕度40%～70 %。

1.2 主要試劑及儀器

ENU，CAS：759-73-9，LOT# MKBX 4322 V，Sigma；CP，批號：SJ0121RA14，上海源葉生物科技有限公司；DPBS，LOT：1546333，2017-02，Gibco；胎牛血清(FBS)，批號：141012，杭州四季青生物工程材料有限公司。FITC Mouse Anti-Rat CD59，貨號：550976，批號：4233743；PE Mouse Anti-Rat CD45抗體，貨號：554878，批號：7054649，BD公司；

BD FACSCanto II 流式細胞儀；KDC 1044低速離心機。

1.3 實驗方法

動物經檢疫合格后，將SD大鼠按體重和外周血RBCCD59-隨機分為4組，即溶媒對照組，ENU 10 mg/kg給藥組，ENU 40 mg/kg給藥組和CP 40 mg/kg給藥組，每組6只。采用腹腔注射染毒，各組染毒1次，溶媒對照組注射PBS溶液。在染毒前和染毒后7、14、28、42、56 d進行眼眶靜脈叢采血，采用乙醚麻醉，稱重并采抗凝血，置于冰上保存備用。

吸取1.5 μL抗凝血，加入200 μL含1%胎牛血清的PBS溶液的流式管中，輕微震蕩數秒。加入2.5 μL anti-CD45和1 μL anti-CD59，輕輕轉動，使抗體混合均勻，室溫暗處避光孵化約30 min。離心棄上清液，加入約0.5 mL含1%胎牛血清的PBS溶液，輕輕轉動，上流式細胞儀檢測，每個樣本檢測100萬個紅細胞[5-7]，分析大鼠外周血RBCCD59-發生率。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 ENU和CP對大鼠體重的影響

與溶媒對照組比較，ENU 10 mg/kg給藥組和ENU 40 mg/kg給藥組各時間點體重及體重增量均無明顯影響(P> 0.05)，CP 40 mg/kg給藥組給藥后時間點體重及體重增量均下降(P< 0.05)。說明ENU 10 mg/kg和40 mg/kg劑量對大鼠體重沒有影響，而40 mg/kg劑量的CP可降低大鼠體重。結果見表1、圖1。

表1 ENU和CP對各時間點大鼠體重的影響結果

注：與溶媒對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the control group,*P< 0.05，**P< 0.01.

圖1 ENU和CP對各時間點大鼠體重的影響結果Fig.1 Effect of ENU and CP on the body weight of rats at different time points

2.2 ENU和CP對大鼠外周血RBCCD59-發生率的影響

與溶媒對照組比較，CP 40 mg/kg給藥組給藥后第28、42和56天，ENU 10 mg/kg給藥組給藥后第42、56天，ENU 40 mg/kg給藥組給藥后第7、14、21、28、42和56天外周血RBCCD59-發生率均升高(P< 0.05)。與ENU 10 mg/kg給藥組比較，ENU 40 mg/kg給藥組給藥后第7、21、28、42和56天外周血RBCCD59-發生率均升高(P< 0.05)。結果見表2、圖2。

3 討論

隨著科學研究的發展，如何最大限度減少實驗動物的使用數量，快速又準確的得出遺傳基因的改變是現階段研究的重點。在Pig-a基因突變檢測方法建立的過程中，國內外研究發現，Pig-a基因突變造成外周血紅細胞表面CD59的缺失是一個逐漸累積的過程，這對檢測有微弱遺傳毒性的物質是一種很有意義的方法。目前的研究主要集中在陽性誘變劑ENU、4NOQ、EMS等的篩選、檢測指標的種類及相關性等方面。而CP作為傳統遺傳毒性試驗檢測方法中最常見的陽性致突變劑，在Pig-a基因突變試驗中研究卻甚少。本試驗主要研究CP傳統遺傳毒性試驗常用劑量 40 mg/kg和同劑量下的ENU，以ENU 10 mg/kg劑量，于給藥后第7～56天對外周血RBCCD59-發生率的影響。

表2 ENU和CP對各時間點大鼠外周血RBCCD59-發生率的影響結果

注：與溶媒對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與ENU10 mg/kg給藥組比較，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note.Compared with the control group,*P< 0.05，**P< 0.01. Compared with the ENU 10 mg/kg group，#P< 0.05，##P< 0.01.

注：A：空白對照FSC-A/SSC-A圖；B：空白對照PE-A/SSC-A圖；C：空白對照FITC-A/SSC-A圖；D：溶媒對照組；E：CP 40 mg/kg給藥組；F：ENU 10 mg/kg給藥組；G：ENU 40 mg/kg給藥組。圖2 ENU和CP對大鼠外周血RBCCD59-發生率的影響結果Note.A: FSC-A/SSC-A chart of the blank group. B: PE-A/SSC-A chart of the blank group. C：FITC-A/SSC-A chart of the blank group. D: Control group. E: CP 40 mg/kg group. F: ENU 10 mg/kg group. G: ENU 40 mg/kg group.Fig.2 Effect of ENU and CP on the loss rate of RBCCD59- at different time points

試驗結果顯示，CP 40 mg/kg給藥組給藥后第28天出現陽性結果，至給藥后第56天仍有顯著性差異，檢出陽性結果的時間較ENU時間延后，且引起大鼠體重的下降較為明顯，不推薦作為該實驗的陽性致突變物。ENU 40 mg/kg給藥組和10 mg/kg給藥組分別于給藥后第7、42天出現穩定的陽性結果，且ENU40 mg/kg劑量較10 mg/kg劑量引起外周血RBCCD59-發生率高，但對大鼠體重沒有影響。可以得出，相同劑量下，ENU引起大鼠外周血RBCCD59-發生率升高效果優于CP，且40 mg/kg劑量優于10 mg/kg劑量，檢驗周期以28 d為宜。

ENU和CP作為常用烷化劑類致突變誘變劑，可直接與DNA發生交叉聯結，干擾DNA和RNA功能，進而導致基因突變。ENU引起外周血紅細胞表面蛋白CD59缺失率高于CP，猜想可能是ENU和CP對造血干細胞和有限自我更新能力的定向細胞的影響程度不同[9]。ENU是常用的有效的致突變劑，大量的文獻報道其可引起Pig-a基因突變發生率的增加[2,7,9-10]，我們的試驗結果也驗證了這一結果。CP作為常用的遺傳毒性試驗陽性物，Kimoto等[8]研究發現，連續10 d給予大鼠5 mg/kg劑量的CP，外周血RBCCD59-未見統計學差異，而Walker等[11]研究發現給予大鼠20 mg/kg的CP 8周后，外周血RBCCD59-是對照組的2～3倍，和我們的試驗結果保持一致。但總的來說，CP引起外周血RBCCD59-效果并不明顯，至少不會引起X染色體上Pig-a或者Hprt基因的明顯突變。

但本試驗不足之處在于，未能從多方面全面評價陽性致突變物引起的大鼠外周血Pig-a基因突變，后期試驗可以增加對網織紅細胞表面CD59缺失率，網織紅細胞微核率等相關指標的研究[12]，采用多指標聯合評價該方法靈敏度。

在本試驗條件下，綜合大鼠體重和外周血RBCCD59-發生率兩個指標，我們得出ENU 40 mg/kg劑量引起大鼠外周血Pig-a基因突變的效果更優，采用流式細胞術方法，能夠利用小樣本量相對迅速地得到較為精確的結果，具有連續、動態監測等優點，該方法可以考慮應用到常規毒性研究中，用于化學物、化妝品等的急性、慢性暴露引起的遺傳毒性篩查。

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