微衛星DNA標記對BABL/c突變卷毛小鼠遺傳特性的分析

李曉娟，孫兆增，馮 帆，姜棋予，孫慧偉，李 潤，柴燕濤，侯 俊*，李瑞生*

(1.解放軍第302醫院臨床研究管理中心，北京 100039； 2.軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071)

實驗動物遺傳背景的一致性和多樣性，是衡量實驗動物品質的一個重要因素，因此在實驗動物的飼養與繁育中，發現和培育具有特殊生物學性能的動物品系是非常重要的[1]。本實驗室于2012年發現的BABL/c卷毛小鼠，通過五年多的近交培育現已完全成為一個遺傳穩定的近交系突變卷毛小鼠品系[2]。微衛星又稱短串聯重復序列(short tandem repeat，STR)，作為分子標記在實驗動物的遺傳質量檢測和科學研究中已得到了廣泛地應用[3-6]。本研究將高通量的熒光PCR技術應用到小鼠微衛星DNA遺傳檢測中，利用篩選出的38個微衛星位點標記對BALB/c正常小鼠、突變卷毛小鼠和突變無毛小鼠等三個品系進行檢測分析，旨在了解BALB/c突變卷毛小鼠與正常近交系BALB/c小鼠的遺傳背景是否存在差異以及差異的程度，以期建立近交系BALB/c突變卷毛小鼠種質資源的遺傳特性，為后期建系保種、品系培育以及科學研究提供重要的科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取近交培育的SPF級BALB/c突變卷毛小鼠(來源解放軍第302醫院動物實驗室)、BALB/c正常小鼠和突變無毛小鼠(來源軍事醫學科學院實驗動物中心[SCXK(軍)2012-0004])各10只，雌雄各半，體重18～20 g。本實驗室使用許可證[SYXK(軍)2012-0010]，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA樣本制備

取小鼠尾巴剪成米粒大小，加入DNA提取液和蛋白酶K過夜消化，采用酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，最終稀釋成50～100 ng/μL作為DNA模板[7]。

1.2.2 微衛星位點的選擇及熒光標記

本研究選D1Mit365、D2Mit15、D2Mit30、D3Mit29、D3Mit51、D4Mit235、D5Mit48、D6Mit8、D6Mit15、D6Mit102、D7Mit12、D7Mit281、D8Mit14、D8Mit33、D8Mit113、D9Mit21、D9Mit23、D10Mit12、D10Mit180、D11Mit4、D11Mit128、D12Mit7、D12Nds11、D12Mit147、D13Mit3、D14Mit3、D14Mit102、 D15Mit5、D15Mit15、D16Mit9、D16Mit145、D17Mit36、D17Nds3、D18Mit9、D18Mit19、D18Mit94、D19Mit3和DXMit16等38個微衛星位點參考MMDBJ 數據庫(Mouse Microsatellite Data Base of Japan) 及文獻[8]，以在不同小鼠品系間多態信息豐富的位點為主，均勻分布于19條常染色體和X染色體上，引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成，各微衛星位點上游PCR引物的5’端均用FAM熒光染料進行標記。

1.2.3 熒光引物PCR擴增

PCR反應體系為10 μL: 2×Type-it Multiplex PCR Master Mix 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL，模板DNA 0.5 μL，RNase-free water補足10 μL。PCR反應程序: 95℃預變性5 min；95℃變性30 s；退火溫度58℃和53℃，30 s；72℃延伸30 s；20個循環；72℃繼續延伸10 min；擴增產物4℃保存。

1.2.4 PCR 產物檢測及STR掃描

四種PCR產物各取0.3 μL、分子量內標0.5 μL和去離子甲酰胺9.5 μL混合加入PCR板，95℃變性5 min，4℃冷卻后離心，1× buffer緩沖液上機檢測。將熒光標記的PCR產物通過ABI3730 測序儀的毛細管凝膠電泳進行掃描檢測，用Genemarker 2.2.0 軟件收集測序儀毛細管凝膠電泳的數據，用Gene Mapper軟件分析各位點的片段大小。

2 結果

2.1 三個品系小鼠間STR掃描相同微衛星位點結果分析

對三個品系小鼠的38個微衛星位點STR掃描檢測結果顯示：BALB/c突變卷毛小鼠與正常小鼠間有27個位點的DNA片斷完全相同，且突變卷毛雌雄鼠間也完全相同，如D2Mit30位點(見圖1)，與無毛突變鼠間有26個位點相同；而無毛突變鼠與正常小鼠間有30個位點相同(見表1)。

2.2 三個品系小鼠間STR掃描不同微衛星位點結果分析

STR掃描檢測結果顯示：BALB/c突變卷毛小鼠與正常小鼠間有11個位點存在差異，而突變卷毛雌雄鼠間完全相同，如D6Mit15位點(見圖2)，與無毛小鼠間有12個位點存在差異，且卷毛鼠與其他兩個品系間有5個位點交叉存在差異；而正常BABL/c鼠與無毛鼠間有8個位點存在差異(見表1)。

2.3 三個品系小鼠間差異性位點的數量及遺傳突變率的分析

38個位點中BALB/c突變卷毛鼠與正常小鼠間有11個位點發生突變，其突變率為28.9%，與無毛小鼠間有12個位點存在差異，其突變率為31.6%；而BALB/c突變無毛小鼠與正常鼠間有8個位點發生突變，其突變率為21.1%。結果表明BALB/c突變卷毛鼠的突變率明顯高于無毛小鼠(見表2)。

注：A：BALB/c正常鼠(♂)；B: BALB/c無毛鼠(♂)；C～D: BALB/c卷毛鼠(♂)；E～F: BALB/c卷毛鼠(♀)；A～F波峰值全部相同；縱坐標為波峰高度，橫坐標為掃描時間。圖1 D2Mit30位點的微衛星掃描波形Note.A: BALB/c mouse(♂). B: Mutant hairless mouse (♂). C-D: Mutant curly mice (♂). E-F: Mutant curly mice (♀). The peaks are all the same in A-F．Y-axis is the peak height, X-axis is the scan time．Fig.1 The waveforms of loci D2Mit30 in STR scanning

注：A：BALB/c正常鼠(♂)；B: BALB/c無毛鼠(♂)；C～D: BALB/c卷毛鼠(♂)；E～F: BALB/c卷毛鼠(♀)；A～B與C～F的波峰值不同；縱坐標為波峰高度，橫坐標為掃描時間。圖2 D6Mit15位點的微衛星掃描波形Note.A: BALB/c mouse (♂). B: Mutant hairless mouse (♂). C-D: Mutant curly mice (♂). E-F: Mutant curly mice (♀).The peaks in A-B are different from that in C-F．Y-axis is the peak height. X-axis is the scan time．Fig.2 The waveforms of loci D6Mit15 in STR scanning

序號No.位點Loci正常鼠♂Normal mouse♂卷毛鼠♂Curlymouse♂卷毛鼠♂Curlymouse♂卷毛鼠♂Curlymouse♂卷毛鼠♀Curlymouse♀卷毛鼠♀Curlymouse♀卷毛鼠♀Curlymouse♀無毛鼠♀Hairless mouse♀正常鼠♀Normal mouse♀1D2Mit151401401401401401401401401402D2Mit301301301301301301301301301303D3Mit512562562562562562562562562564D4Mit2359393939393939393935D6Mit81871871871871871871871871876D6Mit1021321321321321321321321321327D7Mit12198/200198/200198/200198/200198/200198/200198/200198/200198/2008D7Mit2811371371371371371371371371379D8Mit3322222222222222222222222222210D8Mit11315915915915915915915915915911D9Mit2320520520520520520520520520512D10Mit1223823823823823823823823823813D11Mit424624624624624624624624624614D12Mit7119/121119/121119/121119/121119/121119/121119/121119/121119/12115D14Mit10213313313313313313313313313316D14Mit322822822822822822822822822817D15Mit596969696969696969618D16Mit145115/129115/129115/129115/129115/129115/129115/129115/129115/12919D16Mit912412412412412412412412412420D17Mit3611111111111111111111111111121D17Nds312312312312312312312312312322D18Mit915515515515515515515515515523D19Mit319819819819819819819819819824DXMit1693939393939393939325D9Mit2119219219219219219219221419226D12Nds1117817817817817817817817617827D15Mit1515615615615615615615614615628D1Mit3651069494949494949410629D11Mit12812512712712712712712712712530D3Mit2920314514514514514514514720331D6Mit1519415215215215215215219419432D8Mit1416313913913913913913916316333D10Mit18014812812812812812812814814834D12Mit14718914914914914914914918918935D13Mit318916516516516516516518918936D18Mit1915415215215215215215215815437D18Mit9414012412412412412412414014038D5Mit48194202202202202202202226194

表2 38個微衛星位點在三個小鼠種群中的突變率

3 討論

微衛星DNA標記主要具有分布廣、多態性高、遺傳穩定、數量多和片段短容易擴增等優勢，而被作為一種非常重要、成熟的遺傳工具廣泛應用于各類實驗動物的遺傳檢測和科學研究中[9]。小鼠基因組圖譜已包含了7377個微衛星DNA，其中有6580個具有顯著的多態性[10]，能夠更全面地反映出基因組的遺傳特性及變異情況。目前應用微衛星標記方法不但可以進行純合位點的判定，而且還能對基因位點的變異情況進行統計分析[11]。DNA全自動測序儀的毛細管凝膠電泳技術是近年來快速發展起來的一種新技術，該技術將熒光標記的PCR產物和標準分子量樣品(內參) 在同一毛細管中進行電泳，DNA分析儀將結果自動記錄在計算機上，利用片段分析軟件進行圖像收集和分析，而更精確地計算出微衛星位點的等位基因片段大小，是遺傳檢測研究的主要發展方向[12]。

由于BALB/c突變卷毛小鼠和無毛小鼠均是由正常BALB/c小鼠突變產生的[13]，因此本研究結合熒光PCR檢測方法和毛細管凝膠電泳法應用到微衛星的分型檢測中，將篩選的38個微衛星位點對正常BALB/c小鼠、BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/c突變無毛小鼠這三個群體的遺傳背景進行檢測分析，結果發現38個微衛星位點在BALB/c突變卷毛小鼠和正常小鼠之間有27個微衛星位點是完全相同的，有11個位點存在差異，其突變率為28.9%(11/38)接近三分之一，顯示其突變率較高。而BABL/c無毛小鼠與正常小鼠之間有30個位點相同，8個位點存在差異，其突變率為21.1%(8/38)，相比發現突變卷毛小鼠其突變率明顯高于無毛小鼠。而BABL/c突變卷毛小鼠與無毛小鼠之間也有12個位點存在差異，證明了卷毛小鼠突變與無毛小鼠突變是兩個完全不同的突變系。突變無毛小鼠的生理生化指標、染色體定位以及皮膚結構的差異都已得到了證實[13]。實驗前期本實驗室也證實了BABL/c突變卷毛小鼠的血液生化指標、皮膚組織結構以及生長發育指標均與正常小鼠存在差異[14-15]，從而說明了BALB/c突變卷毛小鼠是一個非常寶貴難得的突變系小鼠。

總之，本實驗應用38個微衛星位點結合熒光PCR微衛星標記檢測技術，對BALB/c突變卷毛小鼠的變異情況進行遺傳檢測分析，旨在發現BALB/c突變卷毛小鼠與正常小鼠之間存在的差異以及差異的程度，為今后進一步研究BALB/c突變卷毛小鼠的遺傳特性和未來開發應用該突變系小鼠模型提供可靠的理論參考。

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