不同刺激環境對小鼠諾如病毒在RAW264.7細胞中復制的影響

劉捷

（解放軍南京總醫院比較醫學科，南京 210002）

0 引言

小鼠諾如病毒（murine norovirus，MNV）可以在傳代細胞小鼠巨噬細胞系RAW264.7內生長并產生細胞病變效應（cytopathic effects，CPE）[1]，因為小鼠諾如病毒是目前為止發現的僅有的能在體外進行有效增殖的病毒株，因此可作為體外研究諾如病毒的理想材料，諾如病毒具有很強的抗原性，感染后發病主要表現為急性腸胃炎，現無可應對其感染的疫苗[2]。通過研究不同刺激環境對小鼠諾如病毒在RAW264.7細胞中復制的影響，可有助于運用傳代細胞小鼠巨噬細胞系RAW264.7進行小鼠諾如病毒的培養、增殖和分離[3]。對于除小鼠諾如病毒外其他種類諾如病毒的研究、檢測及疫苗研發工作有積極作用。試驗通過比較不同培養條件下，使用RAW264.7細胞培養病毒的效果，探索培養液酸堿度，胰酶含量對小鼠諾如病毒在RAW264.7細胞中復制的影響。

1 材料與設備

1.1 試驗材料與試劑

試驗中使用的病毒株為本實驗室分離鑒定所得的小鼠諾如病毒；傳代細胞小鼠巨噬細胞系RAW264.7購自上海紀寧；培養基（DMEM）和胎牛血清購自維森特生物技術（南京）有限公司；Hank's生物緩沖液由北京索萊寶科技有限公司生產；胰蛋白酶由武漢千潤生物工程有限公司生產。

1.2 試驗儀器與設備

試驗儀器與設備有培養瓶、試管、移液管、巴斯德吸管、廢液缸、75%酒精棉球、酒精燈等，見表1。

表1 試驗儀器

儀器名稱 型號 產地超凈工作臺 SW-CJ-IBU 蘇州凈化設備有限公司熒光顯微鏡 Olympus BX51 日本電熱恒溫培養箱 HNY-2112B 天津市歐諾儀器儀表有限公司

2 試驗方法

2.1 小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞的培養

試驗用具消毒：超凈臺用酒精擦凈紫外照射20 min左右，試驗前將培養液及藥品加溫到37 ℃，所有操作盡量靠近酒精燈火焰，防止細胞間交叉污染。

當細胞貼壁生長到瓶底70%時，棄去培養液，加PBS 10 mL漂洗1～2次，將漂洗液棄去。加入5 mL PBS，將細胞刮下后用移液槍反復吹打溶液，將有細胞的培養液分入新的培養瓶，放置到37 ℃、5% 的CO2孵箱中，幾小時后細胞即可再次貼壁生長。另外，定時觀察細胞生長情況，及時進行傳代操作[4]。

2.2 細胞試驗設計

2.2.1 不同酸堿度培養液對小鼠諾如病毒在RAW264.7細胞上適應的影響

病毒的穩定pH范圍為6.0～8.0，當培養液的pH小于4.0或者大于9.0時，病毒的感染能力會被過酸或過堿的環境破壞，同時細胞的生長形態改變受其影響較小，因此在設計試驗的pH范圍時，先將配置好的培養液在培養箱里放至少15 min，使溶液的二氧化碳達到飽和，當培養液溫度到37 ℃后，測量其pH。通過添加酸或堿，配置pH濃度梯度為6.0、6.5、7.5、8.0的DMEM培養液，接入已感染MNV的小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞，同時設置不變條件對照組。

2.2.2 不同胰酶濃度對小鼠諾如病毒在RAW264.7細胞上適應的影響

設計試驗的胰蛋白酶培養基中范圍為5、6、7 μg/mL，接入已感染MNV的小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞，同時設置一組不加胰酶的對照組。

2.3 病毒接種和細胞病變形態觀察

小鼠諾如病毒在感染宿主細胞后細胞病變表現為細胞邊緣不整齊，部分核固縮，細胞死亡等[5]。培養18 h后觀察細胞病變情況。

2.4 免疫熒光試驗

將培養一段時間后的試驗組和對照組細胞孔中的營養液棄去，用PBS洗滌3次，室溫干燥后，預冷80%丙酮（4 ℃）固定10 min。PBS洗滌后充分干燥備用。加入兔抗MNV VP1多克隆抗體（實驗室制備），37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后，加入Alexa Fluor 555標記的熒光二抗（碧云天生物技術公司），37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后備用，在熒光顯微鏡下觀察。

2.5 數據分析

每個樣品進行3次平行試驗，紀錄試驗數據并制作數據表格。

3 結果與討論

3.1 細胞病變形態觀察

定時抽取接種了小鼠諾如病毒培養液中的細胞進行觀察，在顯微鏡下觀測到細胞形態發生了改變，正常形態下RAW264.7細胞為圓形、貼壁生長、生長速度較快、細胞難消化，在被病毒感染后，在顯微鏡下觀察到細胞邊緣不整齊，部分核固縮，細胞死亡。

3.2 酸堿度對病毒在細胞中復制的影響

小鼠諾如病毒在培養液pH在7.5左右時，在巨噬細胞系RAW264.7中的復制最活躍，在培養液pH為6.0～6.5時，病毒的復制最不活躍，見表2。

表2 不同pH下MNV感染RAW264.7情況

3.3 胰酶添加量對病毒在細胞中復制影響

小鼠諾如病毒在培養液胰酶添加量為6～7 μg/mL時，在巨噬細胞系RAW264.7中的復制最活躍，見表3。

表3 不同胰酶添加量下MNV感染RAW264.7情況

4 結論

當使用小鼠諾如病毒感染細胞后，由于病毒具有抗原的性質，使感染后的巨噬細胞系RAW264.7在遇到相應的抗體時發生抗原抗體特異性反應，在固定于培養孔上會形成抗原抗體復合物。由于加入的第二抗體熒光素結合物仍然能與發生了抗原抗體特異性反應的復合物結合，將會再次發生抗體抗原反應，最后通過熒光發光。因此，可以通過觀察在熒光顯微鏡下熒光的有無和強弱，進而判斷病毒在細胞中的復制情況。

試驗表明，體外培養小鼠諾如病毒感染RAW264.7細胞時，當控制其他變量恒定時，隨著培養液pH的改變，小鼠諾如病毒的復制在酸性條件下不變，在堿性條件下病毒復制速率加快。隨著胰酶添加量的增加，對小鼠諾如病毒的復制速率增加。通過對以上試驗結果進行分析，小鼠諾如病毒在小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞中最佳培養條件是放置37 ℃、5% CO2培養箱中培養。其中當DMEM培養液的pH為7.5左右或者胰酶的含量在6～7 μg/mL時，小鼠諾如病毒的復制速率加快。為便于觀測和試驗的準確性，含有小鼠諾如病毒的細胞傳代次數應控制在4代以內。