炙馬錢子對EAMG大鼠IL-4 IL-6的影響

泮俊 裘濤 楊峰 鄒瑩 陶水良?

重癥肌無力（Myasthenia gravis，MG）指主要由乙酰膽堿受體抗體介導、細胞免疫依賴、補體參與、主要累及神經肌肉接頭突觸后膜乙酰膽堿受體的獲得性自身免疫性疾病［1］。目前西醫(yī)治療主要有膽堿酯酶抑制劑、免疫抑制劑治療、靜脈注射丙種球蛋白、血漿置換、胸腺切除等。這些治療方法效果均不理想。經作者臨床應用，認為馬錢子治療MG有確切療效［2］。本實驗通過檢測EAMG大鼠IL-4、IL-6的表達，初步揭示炙馬錢子對MG免疫機制的影響，為炙馬錢子治療MG提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物：SPF級8周齡Lewis大鼠50只，雌性，體質量220～260g（浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供）。（2）主要藥物：炙馬錢子膠囊（200mg/粒，浙江省中醫(yī)院中藥制劑室）；新斯的明注射液（上海信誼金朱有限公司）；阿托品注射液（0.5mg/支，浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司）；強的松片（5mg/片，浙江仙琚制藥股份有限公司），實驗時用0.2%的梭甲基纖維素鈉將其配制成所需濃度的混懸液。（3）主要試劑：鼠源性AChR-a亞基97-116肽段序列（the rat sequence 97-116 of the AChR a subunit，R97-116）、完全福氏佐劑（CFA）、磷酸緩沖液（PBS），大鼠IL-6、TGF-β1、AChRab ELISA檢測試劑盒。

1.2 方法 （1）EAMG動物模型建立：本實驗參考Tihamer等［3］和許文華等［4］的模型制備法復制EAMG實驗動物模型。將R97-116、CFA、PBS三者按1：1.5：1.5的比例充分混勻制成免疫乳劑；首次免疫：取乳劑200μl（含R97-116：100μg）于造模鼠足墊、腹部、背部多點皮下注射，正常對照組（A組）皮下注射等量PBS；首次免疫后第30天及第45天，取乳劑200μl（含R97-116：50μg）強化接種，A組注射等量PBS。（2）模型評估標準：①臨床評估：通過測量體重和肌力評價疾病嚴重性。實驗前及接種后2次/周稱重，末次免疫2周后觀察其攝食、姿勢及活動情況。測量肌力（即讓鼠重復抓握籠頂30s再測量）采用Berman等［5］的分級法予以臨床評分，肌力具體分級為：0級，無肯定的肌無力表現；1級，撕咬無力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活動減少且易疲勞；2級，明顯無力，在抓握前就出現震顫、低頭、隆背，抓握力弱；3級，在抓握前即有嚴重的肌無力表現，無力抓握，頻死狀態(tài)；4級，死亡。②新斯的明試驗：用腹腔注射法給予新斯的明（37.5μg/kg）和硫酸阿托品（15μg/kg），12min后大鼠肌無力癥狀可緩解，持續(xù)2～12h。（3）實驗分組：從50只大鼠中隨機取6只為正常組（A組），剩余進行EAMG造模。實驗大鼠約于第2次注射后2周左右大鼠陸續(xù)發(fā)病，分別對大鼠進行模型及臨床評估后，將建模成功的大鼠依據模型評估標準均衡隨機分為模型組（B組）、陽性藥物組（C組）、炙馬錢子低劑量組（D組）、炙馬錢子中劑量組（E組）、炙馬錢子高劑量組（F組）各6只，分籠喂養(yǎng)（自由飲水、攝食）。（4）給藥劑量與方法：根據裘昌林［6］在人體中馬錢子的用量及動物與人藥物劑量的換算公式，分別予以灌胃給藥，1次/d，炙馬錢子低、中、高劑量組分別以 75mg/（kg·d）、150mg/（kg·d）、225mg/（kg·d）的劑量灌胃治療，1次/d；陽性藥物對照組以強的松4mg/（kg·d）的劑量灌胃治療，1次/d；正常組、模型組稱重后給予藥液等量的蒸餾水灌胃，共治療28d。（5）檢測項目及方法：A、B、C、D、E、F各組治療28d后，禁食12h；采用眼球取血法取靜脈血1.5ml，靜置30min后，3000r/min，離心10min，取上層血清，放置-20℃冷凍保存待測。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）分別檢測細胞免疫指標IL-4、IL-6。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示；對于總體分布不明的小樣本資料，各組間結果比較采用非參數檢驗，若符合正態(tài)分布且方差齊性用單因素方差分析，樣本率的比較用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模前后大鼠肌無力癥狀陽性率比較 按照Lennon評分法對末次免疫2周后的EAMG大鼠模型進行臨床表現評估，結果顯示，造模后全部大鼠新斯的明試驗陽性，Lennon臨床評分0.5～2級，取評分≥1級為肌無力陽性，其中1級大鼠26只，2級大鼠9只，造模前后大鼠肌無力陽性率與造模前比較差異有統計學意義。見表1。

表1 造模前后大鼠肌無力癥狀陽性率比較［n（%）］

2.2 大鼠一般情況觀察 造模第1周，除正常對照組外，其余大鼠出現短暫性肌無力癥狀，其臨床癥狀未經治療可自行緩解；第二次免疫后，大鼠出現進食減少，精神萎靡，活動減少等表現，但肌無力表現不典型；追加免疫后，大鼠叫聲低弱，對環(huán)境刺激反應遲鈍，少動，毛發(fā)干枯，撕咬無力且易疲勞，蜷縮拱背，四肢肌無力表現比較典型，但無呼吸困難，脫水等危重表現。炙馬錢子高劑量組有1只大鼠死亡，最后確定送檢標本為A～E各組6只，F組5只。

2.3 各組大鼠體質量變化情況 見表2。

表2 各組EAMG大鼠治療前后體質量變化差值水平比較［g，（x±s）］

2.4 各組EAMG大鼠血清中IL-4、IL-6含量比較 見表3。

表3 各組EAMG大鼠血清IL-4、IL-6含量的比較［pg/ml，（x±s）］

3 討論

MG是一種獲得性自身免疫性疾病，但MG確切的發(fā)病機制至今尚未闡明確。研究表明，其可能是一種由多基因調控、多種機制參與的復雜性疾病［7］。MG的發(fā)生與發(fā)展涉及多種免疫細胞和細胞因子，其與抗AChR CD4+T細胞的活化，及與B細胞相互作用產生高親和力的特異性AChR抗體密切相關。根據分泌細胞因子的不同，CD4+T 細胞可分為不同的亞型，其中輔助T細胞（Th1）以分泌白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）為主，促進細胞免疫反應；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6 和IL-10，促進體液免疫反應；而Th3細胞則主要分泌轉化生長因子-β（TGF-β），參與免疫抑制機制。特異性AChR抗體通過激活補體系統、促進AChR降解，及AChR功能阻滯等機制損害神經肌肉接頭的結構與功能。某些細胞因子水平的變化有助于判斷疾病的嚴重程度、治療效果和預后，甚至可能找到MG治療的新方法，應用人工干預以提高某些免疫抑制性細胞因子水平或降低某些促炎性細胞因子水平，可能為MG的治療提供新的方向。

Th2細胞分泌IL-4、IL-6、等抗炎細胞因子，主要刺激B細胞增殖并產生抗體，與體液免疫應答相關［8］；IL-4為Th2的特征性細胞因子，主要由活化T細胞產生，可以促進B細胞增殖，使B細胞提呈抗原能力增強，提高巨噬細胞提呈抗原的能力，使其具有殺傷腫瘤細胞的功能。目前IL-4在MG的發(fā)病機制中的作用尚不清楚，不同的研究報道有不同的觀點。有研究［9］發(fā)現MuSK免疫的小鼠中IL-4水平顯著升高，并進一步促使抗MuSK抗體滴度升高，從而加重EAMG的癥狀。本資料中發(fā)現經免疫接種后的模型大鼠血清中IL-4含量較空白對照組有明顯上升，經藥物治療后其含量有不同程度的下降，差異有統計學意義（P＜0.01），尤其予炙馬錢子治療組血清IL-4樣品濃度水平明顯降低，其中中、高劑量組較強的松治療組差異有統計學意義（P＜0.01）。表明炙馬錢子可能通過IL-4下調作用起到改善重癥肌無力癥狀的作用。

IL-6由Th2等多種細胞分泌，B細胞終末分化并分泌抗體的必需因子。IL-6還可以誘導T細胞的活化、增殖和分化，促進T細胞表達IL-2R和IL-2［10］。IL-6受體廣泛表達于多種組織細胞，作為參與免疫應答的重要炎癥介質，在細胞因子網絡發(fā)揮多種效應。較多疾病中均有IL-6的異常分泌，尤其是一些自身免疫性疾病，IL-6在其中起到誘發(fā)和維持免疫炎性反應的功能。研究表明，MG患者血清IL-6水平顯著高于對照組，且MG癥狀改善者其血清IL-6水平也明顯下降，表明IL-6在MG發(fā)病中起促進作用。用AChR進行免疫，發(fā)現IL-6基因缺乏鼠發(fā)生EAMG的比例明顯低于野型鼠［11］。本實驗發(fā)現，EAMG模型鼠血清中IL-6含量相比正常組顯著升高（P＜0.01），這與大多數文獻結果一致。經過藥物治療后IL-6含量出現不同程度的下降，表明炙馬錢子和強的松對降低EAMG大鼠血清中IL-6含量均有明確療效，其中炙馬錢子中、高劑量組比強的松組含量更低（P＜0.01），表明中、高劑量的炙馬錢子在降低IL-6含量方面治療效果優(yōu)于強的松。

馬錢子是毒藥，且治療量與中毒量非常接近。盡管在制備過程中使用浸泡、油炒等工序其目的是為了降低藥物的毒性［12］，但藥物本身超過一定劑量依然可導致藥物中毒。在本實驗過程中，炙馬錢子高劑量組有大鼠在連續(xù)給藥過程中死亡，原因可能就與藥物濃度過高有關。因此，采用炙馬錢子治療重癥肌無力時，劑量的判定非常重要，一定范圍內的高劑量藥物，能夠加強治療效果；反之，毒副作用也相應增加。裘昌林［13］認為馬錢子性雖有毒，但只要經過嚴格炮制、合理地用藥，中毒完全可以避免，并總結出“小劑量漸加量法；分次服用，單劑量不＞0.4g；觀察藥物有效反應，適時調整劑量”的用藥經驗。

綜上所述，炙馬錢子能一定程度的降低EAMG大鼠血清中IL-4和IL-6含量，緩解EAMG的病情，其作用機制和強的松相似，屬于通過抑制免疫活化而達到治療效果，且一定劑量范圍內的炙馬錢子在免疫調節(jié)方面的表現優(yōu)于強的松。

［1］ 重癥肌無力診斷和治療中國專家共識.中國神經免疫學和神經病學雜志,2012,19(6):401-408.

［2］ 裘濤,陳眉.炙馬錢子膠囊治療重癥肌無力31例臨床觀察.中國中醫(yī)藥科技,2008,15(3):219-220.

［3］ Tihamer Orban, Peter Blackburn. Methods for treating autoimmune disease by inducing autoantigen-specific regulatory CD4+ T cells:US,2009.

［4］ 許文華,韓瑩瑩,汪思應,等.鼠源乙酰膽堿受體α亞基97-116肽段免疫Lewis鼠誘導實驗性重癥肌無力模型.中國神經精神疾病雜志,2006,32(2):179-180.

［5］ Berman PW. Experimental Myasthenia Gravis:A Murine System Exp.Med,1980,151:204.

［6］ 裘昌林.馬錢子治療重癥肌無力8例.浙江中醫(yī)雜志,1986,31(1):27.

［7］ Conti-Fine BM,Milani M,Kaminski HJ.Myasthenia gravis: past,present,and future.Clin Invest,2006,116:2843-2854.

［8］ Jutel M,Akdis CA. T-cell subset regulation in atopy. Curr Allergy Asthma Rep,2011,11:139-145.

［9］ Ulusoy C, Kim E, Tuzun E, et al. Preferential production of IgG1,IL-4 and IL-10 in MuSK- immuni zedmice. Cl in Immunol,2014, 151:155-163.

［10］ La Flamme AC,Pearce EJ. The absence of IL-6 does not affect Th2 cell development in vivo,but does lead to impaired proliferation,IL-2 receptor expression,and B cell responses. J Immunol, 1999,162:5829-5837.

［11］ Deng C,Goluszko Z,Tuzun E,et al.Resistance to experimental autoimmune myasthenia gravis in IL-6 deficient mice is associated with reduced germinal center formation and C3 production.Immunol, 2002,15:1077.

［12］ 錢松祥.813膠囊的制備及臨床應用.中國中醫(yī)藥科技,2006,13(5):347.

［13］ 裘昌林,金香鸞.馬錢子治療重癥肌無力出現毒性反應及預防措施的探討.中國現代藥學應用雜志,1998,15(2):35.