G試驗聯合GM試驗診斷惡性血液病患者侵襲性真菌病的價值

陳婷婷 劉永林 錢煦岱 李曉芳 包文婷 李強?

侵襲性真菌病（invasive fungal disease，IFD）系真菌侵入人體，在組織、器官或血液中生長、繁殖，并導致炎癥反應及組織損傷的疾病［1］。在惡性血液病患者中，由于長期使用抗生素、激素及免疫抑制劑，自身免疫功能低下，極易得IFD。大部分惡性血液病患者不能耐受明確診斷的侵入性檢查，且傳統鏡檢及真菌培養存在檢出靈敏度不高，培養周期長，延誤抗真菌治療［2］。因此，（1，3）-β-D-葡聚糖（G試驗）和半乳甘露聚糖抗原（GM試驗）非侵入性真菌檢測得到廣泛應用［3］。本文旨在探討G試驗和GM試驗聯合檢測在惡性血液病患者IFD的臨床診斷價值。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2016年1月至10月本院血液科存在高危侵襲性真菌感染因素的患者304例，包括：（1）近期粒細胞缺乏，并持續＞10d。（2）接受異基因造血干細胞移植。（3）使用糖皮質激素＞3周。（4）90d內曾使用免疫抑制劑。（5）有侵襲性真菌感染史。（6）存在免疫缺陷。其中男162例，女142例；年齡4～93歲。304例患者中，淋巴瘤80例，急性髓系白血病60例，再生障礙性貧血48例，骨髓增生異常綜合征29例，多發性骨髓瘤26例，血小板減少癥19例，急性淋巴細胞白血病16例，慢性髓系白血病13例，慢性淋巴細胞白血病9例，其他4例。

1.2 診斷標準 根據2008年歐洲癌癥 和治療組織侵襲性真菌感染協作組和美國國立變態反應和感染病研究院真菌病研究組（EORTC/MSG）對侵襲性真菌病（IFD）的修正定義［4］及國內制定的《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標準與治療原則》指南［5］，本研究不將G試驗和GM試驗結果作為微生物學證據，依據真菌感染可能性將患者分為確診組7例，臨床診斷組32例，擬診組42例和排除診斷組223例。根據治療后療效、臨床癥狀及檢查結果回顧性分析G試驗及GM試驗在惡性血液病中IFD的診斷價值。G試驗聯合GM試驗（并聯）：G試驗或GM試驗結果有一個陽性則判定為陽性；G試驗聯合GM試驗（串聯）：G試驗和GM試驗結果同時陽性則判定為陽性。

1.3 方法 （1）試劑與儀器： G試驗檢測試劑盒采用真菌（1，3）-β-D-葡聚糖檢測試劑盒（動態濁度法），購自湛江安度斯生物有限公司；儀器為捷能確TAL-80E型試管恒溫儀和LKM-02-32型動態試管檢測儀。GM試驗檢測試劑盒采用曲霉菌抗原檢測試劑盒（酶聯免疫法），購自BIO-RAD公司，儀器為BIO-RAD iMark酶標儀。（2）樣本采集：使用不含β-D-葡聚糖的血清采血管和肝素采血管采集患者空腹靜脈血3ml，400g 離心10min，分離血清后置于2-8°C冰箱待測。（3）結果判定：根據G試驗診斷IFD的ROC曲線，選取G試驗最佳臨界值。GM試驗主要用于診斷曲霉菌感染，界值參照試劑說明書，根據待測血清指數I （I=樣本OD值/臨界值對照OD值均值）≥0.50判定GM試驗陽性。陰性對照、陽性對照和臨界對照在每次實驗中必須檢測，以驗證結果的有效性。遇到多次檢測結果，選取抗真菌治療前結果，且1周內重復2次檢測結果均陽性則判斷為陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件。對G試驗診斷IFD的ROC曲線進行分析，分析G試驗及聯合GM試驗在IFD診斷中的靈敏度、特異性、陽性預測值和陰性預測值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 G試驗診斷界值的確定 通過分析304例患者G試驗檢測結果，根據G試驗在IFD診斷的ROC曲線［AUC=0.803（95%CI 0.734～0.878），P＜0.01］， 在 G 試 驗界值定為150.55pg/ml時，其靈敏度和特異性之和最高，G試驗界值定為≥150.55pg/ml，判定陽性。（見圖 1）。

圖1 G試驗在IFD診斷中的ROC曲線

2.2 各組G試驗與GM試驗結果 見表1。

表1 各組G試驗及GM試驗檢測結果

2.3 G試驗、G試驗聯合GM試驗（并聯或串聯）對IFD的診斷效能 以排除診斷組為非感染組，確診組和臨床診斷組為感染組，單獨G試驗診斷靈敏度、特異性、陽性預測值與陰性預測值分別為：66.67%、92.37%、60.46%和94.06%；G試驗串聯GM試驗分別為：38.46%、98.20%、78.94%和90.12%；G試驗并聯GM試驗分別為：82.05%、88.34%、55.17%和96.57%。見表2。

表2 G試驗和GM試驗在感染組中診斷效能（%）

3 討論

G試驗主要檢測（1，3）-β-D-葡聚糖，其主要存在真菌細胞壁中（接合菌和隱球菌除外），在IFD中，機體吞噬細胞吞噬真菌，早期能夠持續釋放（1，3）-β-D-葡聚糖入血和體液，但真菌在體內含量減少時，機體能夠迅速清除（1，3）-β-D-葡聚糖，導致在血或體液中無法檢測，在使用纖維素膜進行血透患者，靜脈注射免疫球蛋白或血制品、鏈球菌血癥、使用多糖類化療藥物等情況，導致G試驗出現假陽性［6］。

GM試驗檢測半乳甘露聚糖抗原，主要適用于侵襲性曲霉菌感染（invasive aspergillosis，IA）的檢測，在曾使用抗真菌治療藥物或者機體感染不嚴重，半乳甘露聚糖抗原含量不高會導致檢測結果假陰性，而在年幼的兒童、食用谷類食品或牛奶制品、使用哌拉西林/他唑巴坦等半合成青霉素等會產生假陽性結果。有文獻報道，在IA診斷中，GM試驗先于培養結果早平均10.5d，先于X射線陽性結果平均5d，先于臨床確診平均17d，可以為及早治療提供依據［7-8］。

本資料確診和臨床診斷患者39例，G試驗陽性26例，GM試驗陽性21例，G試驗并聯GM試驗，靈敏度從66.67%提高至82.05%；G試驗串聯GM試驗，特異性從92.37%提高至98.20%。G試驗聯合GM試驗可以提高在IFD中的診斷效能，指導臨床及早治療，提高生存率。G試驗并聯GM試驗，陰性預測值達到96.57%，高特異性可以輔助排除陰性患者，避免臨床過度抗真菌治療，降低藥物副作用。本資料中，G試驗診斷靈敏度66.67%，接近童彤等［9］報道，但低于本院早期報道［10］，可能和G試驗的診斷界值重新設置，血液病病種組成比例、疾病進程不同，疾病治療方案的改變有關。

目前G試驗檢測試劑盒多樣化，各醫院的患者組成不同，中醫院在臨床用藥中藥占比高，較多中藥存在多糖類成分，因此實驗室需要根據自身檢測結果和臨床診斷建立自己的診斷界值。本資料設置G試驗的診斷界值為150.55pg/ml，較試劑說明書100.5pg/ml高，可能和中醫院大比例使用中藥有關，中藥制品可能含有β-葡聚糖，對G試驗檢測存在干擾。GM試驗主要用于IA診斷，由于本次分析數據中，確診侵襲性曲霉菌患者數量較少，故參考說明書的GM診斷界值，在后續新增病例中，可以探討不同GM的診斷界值在IA中的診斷效能。另外，雖然G試驗并聯GM試驗，提高IFD診斷的靈敏度，但結果并不是很優越，依然存在一部分患者漏檢，錯過最佳搶先治療時機。因此，尋求一些靈敏度更高，特異性依然好的血清學指標仍然是以后努力的方向。

［1］ 廖萬清,陳敏.侵襲性真菌病的診斷:現狀與展望.菌物學報,2011, 30(1): 5-11.

［2］ 馬永超.血液病患者真菌血癥臨床特征回顧性研究.中華醫院感染學雜志, 2016,26(9): 1987-1989.

［3］ Maertens J. Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for invasive aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood, 2001, 97(6):1604-1610.

［4］ Wattal C.Issues in antifungal stewardship: an opportunity that should not be lost. J Antimicrob Chemother, 2017,72(4):969-974.［5］ 孫于謙,黃曉軍.血液系統疾病侵襲性真菌病診治指南解讀. 中國循證醫學雜志, 2015(07): 761-763.

［6］ Pini P.Evaluation of serum (1≥3)-beta-D-glucan clinical performance: kinetic assessment, comparison with galactomannan and evaluation of confounding factors. Infection, 2016, 44(2):223-233.

［7］ Boch T.Diagnosis of invasive fungal infections in haematological patients by combined use of galactomannan, 1,3-beta-D-glucan,Aspergillus PCR, multifungal DNA-microarray, and Aspergillus azole resistance PCRs in blood and bronchoalveolar lavage samples:results of a prospective multicentre study. Clin Microbiol Infect,2016, 22(10):862-868.

［8］ Talento AF.A prospective study of fungal biomarkers to improve management of invasive fungal diseases in a mixed specialty critical care unit. J Crit Care, 2017,40:119-127.

［9］ 童彤,沈繼錄,徐元宏.G試驗聯合GM試驗對惡性血液病患者伴侵襲性真菌病的診斷價值研究.中國微生態學雜志,2016,28(10): 1152-1156.

［10］ 劉永林,趙金方,陳婷婷.血清半乳甘露聚糖聯合血漿1,3-β-D葡聚糖在診斷侵襲性真菌感染中的應用價值. 中華臨床感染病雜志,2014,7(2): 133-136.