川芎揮發油化學成分GC-MS分析及抗氧化活性研究

李生茂 劉 琳 潘 媛 敖 慧* 唐友愛

1.川北醫學院藥學院，四川 南充 637000；2.川北醫學院藥物研究，四川 南充 637000； 3. 川北醫學院附屬醫院內分泌科，四川 南充 637000；4.成都中醫藥大學，四川 成都 611137

川芎為傘形科藁本屬多年生草本植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，始載于《神農本草經》，中醫認為其性溫，味辛，歸肝、膽、心包經，具有活血行氣、祛風止痛的功效[1-3]。現代研究顯示[4-11]，揮發油是川芎主要的活性物質之一，其含有苯酞類、烯萜醇及脂肪酸類等類化學成分，具有解熱、鎮痛、鎮靜、解痙、改善血液流變、降血壓、抗缺血再灌注損傷及抗氧化等多種藥理作用。其中，抗氧化是川芎揮發油重要的活性之一，與其體內對抗實驗動物腦缺血再灌注損傷的作用關系密切[11-12]，但目前有關川芎揮發油的研究，多集中在不同提取方法基礎上的化學成分比較，或單純的藥效評價，而關于其體外抗氧化活性的研究報道較少。基于此，本實驗在水蒸氣蒸餾法獲得川芎揮發油的基礎上，采用GC-MS分析其化學成分，并采用DPPH、ABTS法觀察其抗氧化活性，以期為川芎揮發油的進一步開發利用提供一定的參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 川芎藥材購于成都五塊石中藥材批發市場，經成都中醫藥大學陳璐副教授鑒定為川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖。正己烷(國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20100928)；無水硫酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20140114)；1，1-二苯基苦基苯肼(sigma公司，批號：034K1071)， 蘆丁(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：130824)；2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(aladdin 公司，批號：L1619007)；過硫酸鉀(aladdin公司，批號：A1719017)，甲醇(成都市科龍化工試劑廠，批號：201309230)，水為蒸餾水(自制)。1.2 儀器 Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀(美國安捷倫公司)；Agilent GC-MSD工作站(美國安捷倫公司)；Ohaus Discovery十萬分之一電子分析天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；Epoch 微孔板分光光度計(美國BIOTEK 公司)。

2 方法與結果

2.1 川芎揮發油的制備 取川芎藥材粉碎，過20目篩，稱取粗粉約200g，置2000mL圓底燒瓶中，加入1200mL蒸餾水，按《中國藥典》2015年版一部揮發油測定法進行，水蒸汽蒸餾5h，得川芎揮發油約0.71mL。

2.2 GC-MS 分析

2.2.1 分析條件 GC條件：載氣為氦氣；體積流量1.0mL/min；程序升溫，初始溫度50℃，保持2min；10℃/min速率升至120℃，保持8min；5℃/min速率升至180℃，保持8min；20℃/min速率升至260℃，保持4min，分流進樣，分流比：1∶60；進樣量1μL；進樣口溫度280℃。

MS條件：EI電離；電子能量70 eV；離子源溫度220℃；全掃描方式。

2.2.2 樣品測定 取“2.1”項下制備樣品，加正己烷稀釋，用無水硫酸鈉除去水分，0.45μm微孔濾膜過濾，按“2.2.1”項下色譜條件分析，測定川芎揮發油的總離子流圖，并通過NIST08質譜數據系統檢索并結合文獻報道[13-16]，確定各色譜峰代表的化學成分。川芎揮發油中共檢出73個色譜峰，鑒定了其中的33個色譜峰，其峰面積之和占總峰面積的85.15%，其中烷烴類成分占0.52%，烯烴類成分占9.62%，酚類成分占2.21%，醇類成分占5.33%，醛酮類成分占1.89%，酯類成分占65.04%(其中內酯類成分為63.31%)。結果見表1，圖1。

表1 川芎揮發油化學成分及相對含量

續表

表1 川芎揮發油化學成分及相對含量

續表

表1 川芎揮發油化學成分及相對含量

2.3 體外抗氧化活性測定

2.3.1 清除DPPH自由基 參照文獻方法[17-18]并略做修改，稱取適量DPPH加甲醇配制成濃度為170μmol/L的溶液，避光保存。取川芎揮發油樣品或蘆丁適量，加甲醇溶解并配制成一定濃度的供試品溶液。取0.15 mL供試品溶液與0.15mL DPPH溶液置96孔板，混勻后室溫避光放置60 min，517nm處測定吸收度A1；同時測定0.15 mL供試品溶液+0.15 mL甲醇的吸收度A0，0.15 mL甲醇+0.15 mL DPPH溶液的吸收度A2，按公式計算清除率：DPPH自由基清除率=[1-(A1-A0)]/A2×100%。以清除率(Y)對藥物濃度(X)進行回歸，根據對數函數方程求出清除率為50%時藥物的濃度(IC50)，川芎揮發油清除DPPH自由基的IC50為0.2325mg/mL。同法測定陽性對照蘆丁的IC50值為3.8888μg/mL，結果見圖2，圖3。

2.3.2 清除ABTS自由基 參照文獻方法[17-18]并略做修改， 將10 mL 2 mM ABTS水溶液與100 μL 70 mM過硫酸鉀溶液混合，室溫避光放置12 h，得ABTS儲備液。使用前用甲醇稀釋成工作液，使在734nm波長下的吸光度為(0.70±0.05)。取川芎揮發油樣品適量，加甲醇溶解并配制成一定濃度的供試品溶液。測定時，取0.045mL供試品溶液+0.155mL ABTS溶液置96孔板，混勻后室溫避光放置20min，734nm處測定吸收度A1；同時測定0.045mL供試品+0.155mL甲醇的吸收度A0和0.045mL甲醇+0.155mL ABTS溶液的吸收度A2，按公式計算清除率：ABTS自由基清除率=[1-(A1-A0)]/A2×100%。以清除率(Y)對藥物濃度(X)進行回歸，根據對數函數方程求出清除率為50%時藥物的濃度(IC50)，川芎揮發油清除ABTS自由基的IC50為0.1763mg/mL，同法測定陽性對照蘆丁的IC50值為5.1618μg/mL，結果見圖2，圖3。

3 結論

實驗采用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發油，并采用GC-MS對其化學成分進行分析，共檢測出73個色譜峰，結合文獻報道及NIST08質譜數據系統檢索鑒定了其中33個化合物的結構，所鑒定的化合物色譜峰峰面積之和占總峰面積的85.15%，可以較好地代表川芎揮發油的化學成分特征。而從已鑒定的化合物結構類型來看，川芎揮發油中含量最高的是以Z-藁本內酯(46.17%)為代表的酯類化學成分，占總峰面積的65.04%(其中內酯類成分為63.31%)，其它類成分含量高低依次為烯烴類、醇類、酚類、醛酮類和烷烴類化學成分。

DPPH自由基法、ABTS自由基法是目前常用的研究藥物對自由基清除作用的方法之一[19-20]。筆者結合文獻報道[17-18]，在前期研究基礎上，采用基于96孔板結合酶標儀檢測的方法對川芎揮發油清除DPPH自由基、ABTS自由基的抗氧化活性進行評價，與常用的基于紫外分光光度計測定的清除自由基活性方法比較[11]，具有操作簡便，節省試劑和樣品，并可同時測定多個樣品等優點。結果顯示，川芎揮發油在實驗濃度范圍內，均具有不同程度的清除DPPH自由基、ABTS自由基的活性，并具有較好的量效依賴關系，但其對兩種自由基的清除活性均小于陽性對照蘆丁。

實驗在采用GC-MS分析川芎揮發油化學成分的基礎上，僅觀察了其體外清除DPPH自由基、ABTS自由基的活性，而川芎揮發油對其它自由基有無清除作用及其抗氧化活性物質基礎尚不清楚，值得進一步研究。實驗結果可為川芎揮發油的進一步開發利用提供一定的參考。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志(第五五卷第二分冊)[M]. 北京: 科學出版社, 1985: 239.

[2]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(2015年版一部)[S]. 北京: 中國醫藥科技出版社, 2015: 40-41.

[3]宋平順, 馬瀟, 張伯崇, 等. 芎藭(川芎)的本草考證及歷史演變[J]. 中國中藥雜志, 2010, 25(7): 434-436, 446.

[4]杜旌暢, 謝曉芳, 熊亮, 等. 川芎揮發油的化學成分與藥理活性研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2016, 41(23): 4328-4333.

[5]張達磊, 李桂生. 川芎揮發油的研究進展[J]. 時珍國醫國藥, 2005, 16(7): 664-666.

[6]金玉青, 洪遠林, 李建蕊, 等. 川芎的化學成分及藥理作用研究進展[J]. 中藥與臨床, 2013, 4(3): 44-48.

[7]朱堯, 劉溦溦, 顧寧, 等. 川芎的活性成分及其心血管系統保護作用研究進展[J]. 時珍國醫國藥, 2016, 27(7): 1701-1704.

[8]謝秀瓊, 詹珂, 尹蓉莉, 等. 川芎揮發油的研究進展[J]. 時珍國醫國藥, 2007, 18(6): 1508-1510.

[9]劉露絲, 岳美穎, 李文兵, 等. 當歸油與川芎油的化學成分及其對急性化學性腦損傷保護作用差異研究[J]. 中藥藥理與臨床, 2016, 32(6): 105-108.

[10]楊玉霞. 當歸、川芎、石菖蒲揮發油化學成分分析及抗氧化活性研究[D]. 長春: 吉林大學,2015.

[11]凌婧, 鄧文龍, 張杰, 等. 川芎油對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用[J]. 中藥藥理與臨床, 2008, 24(1): 39-41.

[12]盛艷梅, 孟憲麗, 李春雨, 等. 川芎揮發油對大鼠大腦皮層神經細胞體外存活及腦缺血再灌注損傷的影響[J]. 時珍國醫國藥, 2012, 23(3): 536-538.

[13]王書妍, 張麗, 包玉敏, 等. 川芎揮發油化學成分GC/MS分析[J]. 光譜實驗室, 2010, 27(6): 2174-2176.

[14]謝靜, 張浩, 易濤, 等. 高效液相和氣質聯用色譜法檢測不同方法提取川芎揮發油的化學成分[J]. 中國醫院藥學雜志, 2008, 28(6): 418-421.

[15]吳琦, 楊秀偉. 國家中藥材GAP基地產川芎揮發油化學成分的GC-MS分析[J]. 中國中藥雜志, 2008, 33(3): 276-280.

[16]陳友鴻, 莫尚志, 李潔儀, 等. 川芎揮發油成分研究[J]. 中藥材, 2004, 27(8): 580-582.

[17]惲祥惠, 邢麗娜, 李云, 等. 建立基于96孔板檢測的FRAP法和DPPH法及其在橘核抗氧化活性研究中的應用[J]. 時珍國醫國藥, 2014, 25(5): 1275-1278.

[18]Yu-Ming Chung, Hui-Chun Wang, Mohamed El-Shazly, et al. Antioxidant and Tyrosinase Inhibitory Constituents from a Desugared Sugar Cane Extract, a Byproduct of Sugar Production[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011(59):9219-9225.

[19]王曉宇, 杜國榮, 李華. 抗氧化能力的體外測定方法研究進展[J]. 食品與生物技術學報, 2012, 31(3): 247-252.

[20]張獻忠, 黃海智, 鐘烈洲, 等. 植物提取物體外抗氧化活性評價方法研究進展[J]. 中國糧油學報, 2012, 27(11): 122-128.