祖師麻凝膠膏劑皮膚刺激和過敏性實驗研究

蔡香菊 馬 駿 馬 蘭 王志曉 劉旭霞 沈 薇 石曉峰

1.甘肅中醫藥大學國家中醫藥管理局中醫藥科研三級實驗室中藥藥理實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省第二人民醫院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省醫學科學研究院藥物研究所，甘肅 蘭州 730050

祖師麻味辛、苦，性溫，具有祛風除濕、活血止痛、舒筋活絡、消腫等功效，主治風濕痹痛、四肢麻木、腰痛、跌打損傷、風濕性關節痛等癥。目前，臨床上應用的含有祖師麻的外用制劑為祖師麻膏藥、祖師麻風濕膏和祖師麻關節止痛膏，前兩者為傳統黑膏藥，后者為橡膠膏劑，這些膏劑由于具有載藥量較小(0.2%～2.0%)、生物利用度低、對皮膚有刺激性、使用需要溫熱軟化，貼敷于皮膚上不易揭去等缺點[1]，使其應用受到限制；而凝膠膏劑的載藥量大，一般為5%～10% ，最大可達20%[2]，基質中透皮吸收促進劑、保濕劑、高分子親水基質以及交聯調節劑的使用，使其透皮吸收更好、生物利用度高，且對皮膚刺激小，可反復貼敷[3]，用于皮膚表面涂展性好，無油膩感，不污染衣物。因此，甘肅省醫學科學研究院將以前的祖師麻膏劑通過劑型改變，選用合適的基質，自主研發制成了祖師麻凝膠膏劑，為使其安全進入臨床觀察，進行醫院制劑的申報，同時也為臨床使用提供可靠的科學依據，實驗根據外用藥皮膚實驗的要求，進行了皮膚刺激性實驗和過敏性實驗，現將實驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 祖師麻凝膠膏劑及基質，由甘肅省醫學科學研究院提供；2,4-二硝基氯苯(批號：789204，天津市化學試劑一廠。使用時用丙酮配制成 1% 致敏濃度，0.1% 激發濃度)；硫化鈉(批號：120311，天津市大茂化學試劑廠)；生石灰(批號：120916，上海中秦化學試劑有限公司)。1.2 實驗動物 健康成年新西蘭白家兔16只，雌雄各半，體重2.0～2.5 kg，合格證號：62000600000160，生產許可證號：SCXK(甘) 2015-0001。健康白色豚鼠，18只，雌雄各半，體重 300～400 g，合格證號：62000600000159，生產許可證號：SCXK (甘) 2015-0001。均由中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物場提供。

1.3 方法

1.3.1 祖師麻凝膠膏劑的家兔皮膚刺激性實驗 取16只家兔，給藥24 h前先將背部脊柱左右兩側用剪毛剪剪出面積為3 cm×3 cm的區域，再用脫毛劑(硫化鈉20g+生石灰30 g，用40%乙醇配成200 ml的溶液[4])將該區域脫毛，毛發軟化之后用40℃溫水洗去，再用紙巾擦干脫毛處皮膚即可，24 h后檢查脫毛皮膚是否受傷，受傷的皮膚不能作完整皮膚的刺激性實驗。將16只已脫毛家兔，隨機分為兩組，完整皮膚組和破損皮膚組各8只，破損皮膚組兩側脫毛皮膚用細砂紙摩擦造成局部擦傷，以擦傷表皮、不傷真皮、輕度滲血為度，兩側皮膚的破損程度應基本一致。將祖師麻凝膠膏劑和基質剪成3 cm×3 cm的小方塊，兩組給藥均為左邊基質、右邊藥物，將藥物和基質貼上之后用醫用膠布和紗布纏繞固定，保持藥物與皮膚接觸4 h后去除醫用膠布和紗布，揭去藥物和基質，然后以溫水洗去殘留藥物，分別在0 h、24 h后觀察皮膚刺激性情況。每天給藥1次，連續7 d。末次給藥后，觀察去除藥物后0 h、24 h、48h、72h用藥部位的紅斑和水腫情況，進行皮膚刺激實驗反應評分和刺激強度評價[5-7]。

1.3.2 祖師麻凝膠膏劑的豚鼠皮膚過敏性實驗 將18只豚鼠在給藥24 h前背部右側脫毛，脫毛方法同上，隨機分為3組，第一組為陽性對照2,4-二硝基氯苯組，第二組為受試藥物祖師麻凝膠膏劑組，第三組為基質對照組，每組6只。將1%的2,4-二硝基氯苯(用丙酮配制)0.2 mL滴加于3 cm×3 cm的濾紙上，濾紙貼于第一組右側脫毛區，用1層玻璃紙和2層紗布覆蓋，膠布與紗布固定；將祖師麻凝膠膏劑和基質剪成3 cm×3 cm的小方塊，分別貼敷于第二組和第三組動物的右側脫毛區，用醫用膠布和紗布纏繞固定。給藥后動物單籠飼養，保持藥物與皮膚接觸6 h后去除醫用膠布和紗布，揭去濾紙、藥物和基質，然后以溫水洗去殘留藥物，分別在0 h、24 h后觀察皮膚過敏性情況并評分。第7天和第14天用同樣方式各重復給藥1次并觀察。第28天激發給藥，用上述同樣方法將相應藥物分別貼在各組動物背部的左側脫毛區，其中陽性對照組濃度改用0.1% 2,4-二硝基氯苯激發，基質對照組和受試藥物祖師麻凝膠膏劑組同前，包裹固定6 h后去除藥物即刻觀察，并于24 h、48 h及72 h再次觀察皮膚過敏反應情況并作評分[7-8]，同時密切觀察動物是否出現有哮喘、站立不穩或休克等嚴重的全身性過敏反應。

1.4 評分標準 根據中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術指導原則[6]，按表 1、表 2 評分標準計分并判斷刺激強度。根據中藥、天然藥物免疫毒性(過敏性、光過敏反應)研究的技術指導原則[8]，按表3、4 評分標準計分,按皮膚過敏反應程度評價各組豚鼠皮膚過敏反應分值。

表1 皮膚刺激反應評分標準

表3 皮膚過敏反應評分標準

表4 皮膚致敏性評價標準

2 結果

2.1 家兔皮膚刺激性實驗 祖師麻凝膠膏劑及其基質對破損及完整皮膚連續用藥7天，按照評分標準記錄出現紅斑和水腫分值，并進行刺激強度評價。皮膚刺激實驗反應平均值=(紅斑形成總分+水腫形成總分) /合計動物數[9]。皮膚完整組家兔多次給藥皮膚刺激反應最高平均分值為0.25，說明祖師麻凝膠膏劑及其基質對完整皮膚無刺激性；皮膚破損組家兔在第3、5和6天，去除藥物0h后皮膚刺激反應最高平均分值為0.5，皮膚刺激反應強度表現為輕度刺激性，但在去除藥物24h后即可恢復。見表5、表6。

表5 前6天皮膚刺激反應實驗結果 (n=8)

表6 第7天末次給藥后皮膚刺激反應實驗結果 (n=8)

2.2 豚鼠皮膚過敏性實驗 按表3皮膚過敏性反應評分標準評價記錄各組各時間的平均分值，反應平均分值=(紅斑形成總分+水腫形成總分)/合計動物數[10]。同時還應密切觀察動物是否有哮喘、站立不穩或休克等嚴重的全身性過敏反應出現。根據實驗組和對照組動物皮膚反應的差別，判斷受試物對皮膚過敏反應的性質，并計算過敏反應發生率。過敏反應發生率(%)[11]=(有過敏反應動物例數/合計動物數)×100% ，根據過敏反應發生率判斷受試物的過敏反應強度。陽性致敏組在去除藥物72 h內有不同程度的紅斑與水腫，反應平均值0.8～2.6，致敏率為100%。祖師麻凝膠膏劑及其基質在3次給藥致敏過程中，皮膚過敏反應平均分值均為0；第28 d再次接觸此藥(激發)，即刻觀察直至72 h 后，均無紅斑或水腫反應，亦無哮喘、站立不穩等全身性過敏反應，反應平均值為0，致敏率為0。表明祖師麻凝膠膏劑經皮膚給藥無致敏作用。見表7、表8。

表7 致敏階段豚鼠皮膚過敏反應平均分值 (分)

表8 激發階段豚鼠皮膚過敏實驗結果

3 討論

風濕性關節炎是急性或慢性結締組織炎癥的常見疾病之一，給患者正常生活帶來極大的負面影響，病情可反復發作或累及心臟。其臨床癥狀以關節、肌肉游走性酸痛為特征，受累關節多為肩、膝、踝、肘等大關節，多由一個關節轉至另一關節，病變區域局部呈紅腫、劇痛、灼熱，也可多個關節同時發病。該病屬中醫痹證范疇，臨床表現變化多端，病證復雜，“虛邪瘀”為其基本病機[12]。類風濕性關節炎是一種以多發性、對稱性關節炎癥為主，可引起肢體嚴重畸形的慢性全身性自身免疫性疾病，主要病理改變為關節滑膜慢性炎癥、增生形成絨毛狀突起，侵犯關節軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，最終導致關節畸形和功能喪失。

祖師麻是臨床治療風濕性關節炎和類風濕性關節炎的有效藥物，其提取物祖師麻甲素具有抗炎、鎮痛等作用，在臨床應用中具有獨特的療效優勢。為提高載藥量、增強保濕性、減少對皮膚的刺激性，甘肅省醫學科學研究院結合臨床實踐經驗，改變目前的祖師麻制劑的劑型，將其制成了祖師麻凝膠膏劑，“內病外治”[13]，直接貼敷于關節處，經皮給藥。研究考察了祖師麻凝膠膏劑外用的安全性，結果顯示，祖師麻凝膠膏劑對家兔完整皮膚無刺激性，對破損皮膚有輕度刺激性，但在去除藥物24h后即可恢復，對豚鼠皮膚也未見過敏性反應，表明該制劑皮膚給藥具有較好的安全性。

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