特應性皮炎不同中醫證型外周血T細胞亞群及其相關細胞因子表達的研究

趙一丁，楊 潔，閆小寧，郎 娜

(1. 陜西省中醫醫院，西安 710003； 2. 陜西省中醫藥研究院，西安 710003； 3. 中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091)

特應性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一種慢性、復發性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，初發于嬰兒期，呈慢性經過，常伴有哮喘或過敏性鼻炎，部分患者病情可以遷延至成年，嚴重影響患者及其家庭成員的生活質量。目前AD的病因及發病機制尚未完全明確，一般認為是在一定遺傳背景和(或)環境因素作用下，造成機體皮膚屏障功能障礙或直接引起機體的免疫反應失調，導致變應性或非變應性炎癥反應。T細胞亞群及其相關細胞因子在AD炎性反應的發生發展過程中起重要作用。本研究擬通過探討AD患者外周血T細胞亞群相關細胞因子水平與中醫證型之間的關系，以期為AD的中醫辨證提供微觀科學依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 診斷標準 西醫診斷符合Hanifin與Rajka診斷標準[1]，中醫證型診斷符合國家中醫藥管理局四彎風辨證分型標準[2]，將患者分為風濕蘊膚證和血虛風燥證2型。其中風濕蘊膚證主癥：皮膚潮紅；瘙癢劇烈；糜爛滲出；丘疹水皰；次癥：神倦便溏；遇風濕加重；舌淡苔薄膩；脈弦滑；血虛風燥證主癥：皮膚干燥；肥厚或苔蘚樣變；瘙癢抓痕血痂；病程久，反復發作；次癥：食后腹脹，便秘或溏；皮膚色暗或色素沉著；舌質淡胖；苔白脈滑；當患者符合以上證候中主癥3項或3項以上，同時具備次癥任何2項或2項以上即可診斷為該證型。

1.1.2 納入和排除標準 2歲≤年齡≤60歲，性別不限，符合西醫診斷標準及中醫辨證分型標準，無嚴重心、腦、肝、腎等系統性疾病，排除妊娠及哺乳期婦女，近2周內未接受系統性糖皮質激素、免疫抑制劑治療。

1.1.3 病例來源 表1顯示，選取2015年5月至2017年4月陜西省中醫醫院皮膚科的54例就診病理患者，其中男性30例，女性24例，年齡4～35歲，平均年齡(19.40±8.41)歲；病程4～17年，平均病程(10.01±3.69)年；辨證屬風濕蘊膚證者20例，血虛風燥證者34例；招募健康志愿者20例對照組，其中男性11例，女性9例，年齡13～32歲，平均年齡(20.40±4.54)歲，2組受試者性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 一般資料特征

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 CD4/CD8/CD3檢測試劑盒、Treg檢測試劑盒，美國Beckman-Coulter公司；人白介素-4(IL-4)酶聯免疫分析試劑盒、人白介素-12 (IL-12/P70)酶聯免疫分析試劑盒、人白介素-10(IL-10)酶聯免疫分析試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；流式細胞儀，美國Beckman-Coulter公司，EPICS XL；自動板式酶標儀，北京航宇浪琴醫療設備有限公司ZS-3；臺式離心機，濟南來寶醫療器械有限公司，TD-5 M；電熱恒溫培養箱，黃石市恒豐醫療器械有限公司SKP-02.600)；超低溫冰箱，日本SANYO公司MDF-192等。

1.2.2 檢測方法 分別抽取納入患者及健康志愿者空腹外周靜脈血9 ml(肝素抗凝)，分別注入3個試管中，每管3 ml。

第1管用于細胞因子IL-4、IL-12及IL-10的檢測，采用ELISA法檢測。待檢標本離心(1200 r/min，5 min)吸取上層血清注入EP管中；加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標準品或待測樣品100 μL，將樣品加于酶標板孔底部，37 ℃反應120 min，棄去液體甩干，不用洗滌，每孔加生物素標記抗體工作液100 μL，37 ℃溫育60 min，棄去孔內液體甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，200 μL/孔甩干。每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μL，37 ℃溫育60 min，棄去孔內液體甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，200 μL /孔甩干，依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色，依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應，用酶聯儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度。

第2管以肝素抗凝，用于CD3+、CD4+、CD8+的檢測，采用流式細胞儀。取1支流式管作為樣品測試管，將100 μL抗凝全血(EDTA)加入試管中，在管中加入10μLCD45-FITC/CD3-PC5/CD4-RD1/CD8-ECD抗體，渦旋混勻后室溫避光孵育15 min取出試管，每管加入500 μL紅細胞裂解液OptiLyse C，渦旋混勻室溫避光10 min，1200 r/min離心5 min，棄去上清液每管加入2 mlPBS，渦旋混勻1200 r/min離心5 min棄去上清液，每管加入500 μLPBS混勻，4 ℃避光1 h內上機檢驗。

第3管用于CD4+CD25highCD127lowTreg的檢測，采用流式細胞儀。取2支流式管，編號1(同型對照管)和2(樣品測試管)分別加入50 μL EDTA，在管1中加入10μLCD4-FITC、10μLIgG1-PC5、10μLIgG1-PE抗體，渦旋混勻后，室溫避光孵育20 min，在管2中加入10μLCD4-FITC、10μLCD25-PC5、5μLCD127-PE抗體，渦旋混勻后，室溫避光孵育15 min取出試管，每管加入500 μL紅細胞裂解液OptiLyse C，渦旋混勻室溫避光10 min，1200rpm離心5 min，棄去上清液，每管加入2mlPBS渦旋混勻，1200rpm離心5 min，棄去上清液，每管加入500μLPBS混勻，4 ℃避光1 h內上機檢驗。

在淋巴細胞中以CD3設門，CD4設門，可在以CD3為橫坐標、CD4為縱坐標的二維散點圖上把淋巴細胞分為CD3+CD4+T細胞和CD3+CD4-T細胞；以CD3設門，CD8設門，可在以CD3為橫坐標、CD8為縱坐標的二維散點圖上把淋巴細胞分為CD3+CD8+T細胞和CD3+CD8-T細胞，以CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞各占CD3+T細胞的比例作為CD4+T細胞和CD8+T細胞的表達水平；以CD4設門，可在以CD4為橫坐標、側向散射角(SSC)為縱坐標的二維散點圖上把淋巴細胞分為CD4+T淋巴細胞和CD4-T淋巴細胞。在CD4+T的淋巴細胞中，以CD25、CD127設門，將CD4+CD25+細胞群平均熒光強度10倍的亞型細胞群定義為CD4+CD25highT細胞，獲取設門內細胞團并保存數據，分析CD4+CD25highCD127low淋巴細胞比例，將CD4+CD25highCD127low淋巴細胞作為Treg的水平。

2 結果

2.1 特應性皮炎不同證型外周血T淋巴細胞亞群表達比較

表2圖1～8顯示，風濕蘊膚證及血虛風燥證AD患者外周血CD4+T細胞水平均高于對照組(P<0.05)，但兩證型比較差異無統計學意義(P>0.05)；血虛風燥證AD患者外周血CD8+T細胞水平高于風濕蘊膚證AD患者及對照組(P<0.05)，風濕蘊膚證AD患者外周血CD8+T細胞水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；風濕蘊膚證及血虛風燥證AD患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg細胞水平均明顯低于對照組(P<0.01)，且風濕蘊膚證AD患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg細胞水平低于血虛風燥證(P<0.05)；各組AD患者外周血CD3+T細胞水平及CD4+/CD8+比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組外周血T淋巴細胞亞群占總淋巴細胞比值比較

注：與對照組比較：※P<0.05,※※P<0.01；與風濕蘊膚證組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖1 風濕蘊膚證組CD3+流式直方圖

圖2 血虛風燥證組CD3+流式直方圖

圖3 風濕蘊膚證組CD4+流式散點圖注：C2為CD4+T淋巴細胞

圖4 血虛風燥證組CD4+流式散點圖注：C2為CD4+T淋巴細胞

圖5 風濕蘊膚證組CD8+流式散點圖注：D2為CD8+T淋巴細胞

圖6 血虛風燥證組CD8+流式散點圖注：D2為CD8+T淋巴細胞

圖7 風濕蘊膚證組Treg流式散點圖 注：D門內為CD4+CD25highCD127lowTreg

圖8 血虛風燥證組Treg流式散點圖 注：D門內為CD4+CD25highCD127lowTreg

2.2 特應性皮炎不同證型外周血IL-4、IL-12、IL-17、IL-10水平比較

表2顯示，風濕蘊膚證及血虛風燥證AD患者外周血IL-4、IL-17水平均高于對照組(P<0.05)，且風濕蘊膚證AD患者外周血IL-4、IL-17水平均高于血虛風燥證(P<0.05)；風濕蘊膚證及血虛風燥證AD患者外周血IL-12水平明顯低于對照組(P<0.01)，并且風濕蘊膚證AD患者外周血IL-12水平明顯低于血虛風燥證(P<0.01)，血虛風燥證AD患者外周血IL-12水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，血虛風燥證AD患者外周血IL-10水平高于風濕蘊膚證患者及對照組(P<0.05)，風濕蘊膚證AD患者外周血IL-10水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組血清IL-4、IL-12、IL-10水平比較

注：與對照組比較：※P<0.05，※※P<0.01；與風濕蘊膚證組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

中醫學并無特應性皮炎的病名記載，根據其發病部位、臨床特征及形態，常包括在“浸淫瘡”“四彎風”“奶癬”“胎瘡”“血風瘡”等疾病中[3]。中醫學認為，本病由先天稟賦不足、胎毒遺熱、熱郁肌膚而致；或由后天飲食不節、喂養失當導致脾失健運，復感風濕熱毒，邪毒蘊結肌膚而致；反復發作、遷延日久或后天情志內傷，可致脾虛氣血生化乏源，陰血、元氣耗傷則血虛風燥、肌膚失養。1994年國家中醫藥管理局制定的《中華人民共和國醫藥行業標準·中醫病證診斷療效標準》將本病分為風濕蘊膚證和血虛風燥證兩型[2]。本研究按照此辨證分型標準，通過對2種證型AD患者外周血T淋巴細胞亞群及相關細胞因子的檢測，探討AD中醫辨證的微觀證據。

現代醫學認為，T淋巴細胞亞群、Th1/Th2及Th17/Treg細胞網絡失衡在AD的發病過程中有重要作用。有研究顯示，AD患者外周血CD4+和CD4+/CD8+水平增高，CD8+水平下降，導致體液免疫功能亢進，細胞免疫功能低下[4]。本研究結果顯示，AD患者外周血CD4+T細胞水平均高于對照組，血虛風燥證AD患者外周血CD8+T細胞水平高于風濕蘊膚型AD患者及對照組，說明AD患者體內T細胞的輔助與抑制功能存在失衡。AD急性期主要為Th2細胞活化引起免疫應答，產生IL-4、IL-5及IL-13等，表現為紅斑、丘疹、水皰甚至黃水浸淫、糜爛、結痂，可伴有煩躁不安、大便干結或黏膩、小便短黃、舌紅苔黃膩、脈滑數等，證屬風濕(熱)蘊膚，慢性期免疫反應則向Th1細胞占優勢的免疫應答轉變，IL-12及GM-CSF呈過表達[5]，表現為皮膚肥厚、苔蘚化、干燥、瘙癢劇烈，伴有倦怠乏力、食少腹脹、舌質淡紅少津、苔少、脈沉弦等，證屬血虛風燥。有研究顯示，(風)濕熱蘊膚征象表現越明顯，IL-4、IL-17表達越高，而病久耗傷陰血、血虛風燥，逐漸成為慢性期表現，此時相對較高的IFN-γ表達增加[6]，與本研究結果相符。

Treg細胞是新型CD4+T細胞亞群，主要通過細胞間接觸抑制和分泌抑制性細胞因子如TGF-β、IL-10而發揮免疫調節作用[7]，它與Th17細胞平衡失調可引起AD皮損向急性期發展，Treg細胞可分為CD4+Treg細胞、CD8+Treg細胞、NKT Treg細胞和雙陰性Treg細胞，其中CD4+Treg細胞與特應性皮炎的發病密切相關，CD25是CD4+Treg細胞的分子標志物，但效應性T細胞也表達CD25，只有高表達CD25的CD4+Treg細胞才具有免疫調節作用，而CD127在CD4+Treg細胞表面特異性低表達，檢測時不用破壞細胞膜[8]，因此本研究采用CD4+CD25highCD127low作為篩選Treg細胞的標準。研究結果顯示，AD患者外周血Treg細胞低于健康對照組，說明AD患者體內存在Treg細胞數減少導致免疫抑制效應的不足[9]，且風濕蘊膚證患者外周血Treg水平低于血虛風燥證患者，IL-17水平高于血虛風燥證患者，可能說明慢性期平衡轉向Treg、Th1方向，IL-10呈高表達。在辨證論治過程可以從IL-4、IL-12、IL-17、IL-10水平的高低及CD4+、CD8+、Treg細胞的數量初步判斷患者的病情階段及中醫辨證分型，從而為遣方用藥提供依據。

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