龍膽瀉肝湯加減對尋常型銀屑病患者p38MAPK/IL-17信號通路的影響?

雷 鳴，李偉寧，姚 斌，邵文超，張曉杰△

(1. 山東中醫藥大學，濟南 250014； 2. 寧夏銀川市中醫醫院，寧夏 銀川 750001； 3. 山東中醫藥大學附屬醫院，濟南 250014； 4. 寧夏中寧縣中醫院，寧夏 中寧 755100； 5. 寧夏賀蘭縣中醫醫院，寧夏 賀蘭 750200)

銀屑病(Psoriasis)又名“牛皮癬”，是一種常見且極易復發的慢性炎性皮膚病，主要病理表現為表皮角化過度、角質形成細胞過度增生[1-2]，其病因尚未明確。新近發現的CD4+T細胞Th17亞群及其相關細胞因子與該病發生發展密切相關[3-4]。原始T細胞在TGF-β和IL-6的作用下向Th17細胞分化，成熟的Th17細胞分泌IL-23和IL-17，前者正反饋促進Th17細胞的分化成熟并維持其穩定性[5-6],后者與其相應受體結合后激活下游p38MAPK信號通路[7]，繼而上調IL-6的表達。此外，IL-17還可通過上調IL-8的表達誘導炎性細胞在銀屑病皮損處聚集引起表皮過度角化[8]。那么龍膽瀉肝湯加減治療銀屑病是否通過p38MAPK/IL-17信號通路發揮作用，目前尚未見相關報道。本研究就尋常型銀屑病患者皮損中p38MAPK基因水平及患者口服龍膽瀉肝湯加減治療前后外周血Th17細胞相關細胞因子表達水平總結如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

基因檢測部分：10例銀屑病患者來自于我院皮膚科門診2015年1月至4月就診患者，其皮損取自于我院皮膚科門診行病理檢測(經皮損表現和病理報告均證實為銀屑病)的皮膚組織(病理結果見附圖)，對照組皮膚組織取自外科手術患者切除的正常皮膚。

臨床實驗部分： 2015年5月至2016年4月就診我院皮膚科門診的42例經龍膽瀉肝湯加減治療尋常型銀屑病患者，其中男18例，女24例，年齡18～58歲，平均年齡(39.4±2.3)歲;病程3個月～20年，平均病程(12.8±1.3)年。皮損嚴重指數(PASI)評分按標準[9]計算14.3～28.4分，平均(19.37±2.32)分。健康對照組30例來自我院體檢者，其中男16例，女14例，年齡22～57歲，平均年齡(36.1±3.3)歲。2組性別、年齡等資料經統計學比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 儀器和試劑

ELISA試劑盒(北京索萊寶)，反轉錄試劑盒(00255982，Thermo)，PCR試劑(appled biosystems)，TRNzol Reagent(DP405，天根)， PCR儀(T100TM，Bio-Rad)，電泳成像系統(Tanon1600，天能)，酶標儀(MULTISKAN MK3，Thermo)。

1.3 診斷標準[10-11]

西醫診斷標準：具有典型臨床表現，皮損以丘疹、斑丘疹和大小不等的紅色斑塊上覆有多層干燥銀白色鱗屑皮疹，刮去鱗屑可見一層光亮薄膜，薄膜下可見點狀出血，進行期不斷有新皮疹出現，有同形反應；皮損形態可為點滴狀、斑塊狀、錢幣狀、地圖狀、混合狀等類型；本病經過緩慢，有自限性、易復發，可伴有不同程度的瘙癢；好發于頭皮、四肢伸側及腰骶部。發于頭皮者，毛發呈束狀；發于甲板(指、趾)者，可有頂針樣凹陷或前沿剝離；病理符合銀屑病角化不全、角化過度、Munro微膿瘍；棘層增厚，表皮突下延；真皮乳頭上伸接近角質層，真皮上層血管擴張，血管內皮增生，周圍有圓形細胞浸潤。

中醫診斷標準：主癥：皮損鮮紅；新出皮疹迅速擴大或者不斷增多。次癥：心煩易怒；小便黃；舌質紅或絳；脈弦滑或數。具備所有主癥和1項以上次癥即可診斷。

1.4 方法

1.4.1 p38MAPK基因檢測 根據p38MAPK和GAPDH基因序列設計并合成PCR物:p38MAPK-F: CTCCATAATGGCCGAGCTGT，p38MAPK-R: CC TGTTCTGTCGCGAT；GAPDH-F:AAATCCCATCACCATCTTCC，GAPDH-R:CTGCCCTTT GGCC。提取銀屑病患者皮損處皮膚組織和外科手術切取的正常皮膚組織總RNA，反轉為cDNA，以 cDNA 為模板，PCR法檢測目的基因的表達情況。

1.4.2 細胞因子檢測 分別采取健康對照者和銀屑病患者經龍膽瀉肝湯加減治療前后外周血4 mL，待其自然凝固后離心取上清，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)，檢測血清中細胞因子IL-6、IL-8、IL-17、IL-23及TGF-β的表達情況。

1.4.3 治療方法 龍膽瀉肝湯加減方：金銀花12 g，土茯苓30 g，柴胡9 g，龍膽草9 g，山梔子9 g，黃芩9 g，蒲公英30 g，生地黃15 g，車前子(包煎)15 g，當歸9 g，澤瀉9 g，丹皮15 g，甘草6 g，連翹15 g。水煎取汁400 mL，分2次于早、晚飯后1 h溫服，7 d為1個療程，共4個療程。

1.4.4 PASI評分標準[9]按患者皮損面積和嚴重程度進行PASI評分：皮損嚴重程度按照有無紅斑、浸潤、鱗屑分為無、輕、 中、重、極重，分別計0～4分; 皮損面積按照無皮損、皮損面積 <10%、 10%～30%、 30%～50%、50%～70%、70%～90%、90%～100%分別計0～6分。PASI總分=(0.1×頭部皮損面積損×嚴重程度)+(0.2×上肢皮損面積損×嚴重程度)+(0.3×軀干皮損面積損×嚴重程度)+(0.4×下肢皮損面積損×嚴重程度)。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 基因檢測結果

10例銀屑病患者與健康對照組檢測結果。

2.1.1 p38MAPK基因表達情況 圖1顯示，與健康對照組比較，10例銀屑病患者皮損處p38MAPK基因表達水平均有不同程度的增高，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

圖1 PCR檢測10例銀屑病患者皮損處與健康對照組p38MAPK 基因的表達情況注：與健康對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

2.1.2 p38MAPK基因與PASI 評分相關性分析 10例銀屑病患者皮損處p38MAPK基因表達水平與PASI評分呈正相關(r=0.853，P<0.01)。

2.1.3 外周血IL-17、IL-6表達情況 表1顯示，與健康對照組比較，10例銀屑病患者外周血中細胞因子IL-17、IL-6含量均升高，且升高程度有統計學意義(P<0.01)。

2.1.4 患者p38MAPK基因與IL-17、IL-6相關性分析 表2顯示，10例銀屑病患者外周血IL-17、IL-6的含量與患者皮損處p38MAPK基因的表達水平呈正相關(P<0.01)。

表1 10例銀屑病患者與健康對照組外周血細胞因子IL-17、IL-6表達比較

注：與對照組比較:**P<0.01

表2 10例銀屑病患者外周血細胞因子IL-17、IL-6與皮損處p38MAPK基因相關性分析

2.2 臨床實驗部分

42例經龍膽瀉肝湯加減治療銀屑病患者與健康對照組檢測結果。

2.2.1 患者治療前后PASI 評分比較 治療前患者PASI評分(19.37±2.32)分，經龍膽瀉肝湯加減治療4個療程后，患者PASI評分(4.76±1.30)分較治療前差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2.2 患者治療前后與健康對照組5種細胞因子表達情況 表3顯示，與健康對照組比較，銀屑病患者外周血相關細胞因子IL-6、IL-8、IL-17、IL-23以及TGF-β表達水平均有不同程度升高(P<0.05)，經龍膽瀉肝湯加減治療4個療程后，患者外周血中各細胞因子的表達水平明顯下降(P<0.05)。

表3 各組樣本外周血5種細胞因子表達比較

注：通過Levene方差齊性檢驗得出，3組數據均符合方差齊性(P=0.824>0.05)，故均采用One-way ANOVA檢驗對3組之間進行比較差異有統計學意義

2.2.3 治療組患者治療前后5種細胞因子與PASI 評分相關性分析 表4顯示，銀屑病患者治療前后外周血5種細胞因子(IL-6、IL-8、IL-17、IL-23和TGF-β)的表達水平均與PASI評分呈正相關(P<0.05，P<0.01)。

表4 銀屑病患者治療前后外周血5種細胞因子表達水平與PASI評分相關性分析

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚疾病[1]，其病因復雜，現代醫學關于該病的病因多從遺傳、感染、精神、代謝障礙以及免疫異常等方面論述[12]，而免疫功能紊亂在銀屑病中的作用越來越受到人們的關注。既往研究認為，Th1/Th2比例失衡是導致銀屑病發生的重要因素[2]，但近年來新發現一種CD4+T細胞Th17亞群及其相關細胞因子在銀屑病中所發揮的作用引起人們的重視[3-4]。原始T細胞在TGF-β和樹突狀細胞(CD細胞)分泌IL-6的誘導下向原始Th17細胞分化，IL-23則在其后期分化成熟和維持其穩定過程中發揮重要作用。成熟以后的Th17細胞分泌IL-23和IL-17，IL-23正反饋促進Th17細胞的分化成熟[5-6]，而IL-17與其相應的受體結合可激活p38MAPK[7]。p38MAPK在銀屑病患者非皮損區及正常人表皮中主要表達于胞漿，而在銀屑病患者皮損處被磷酸化激活后轉移細胞核內活化多種核轉錄因子和其他激酶，繼而上調IL-6的表達[13]，進一步誘導原始T細胞向Th17亞群分化。此外，IL-17還可以通過上調IL-8的表達誘導大量炎性細胞在銀屑病皮損處聚集，引起角質形成細胞的過度增殖，促進皮損的發生[8]，說明p38MAPK/IL-17信號通路在銀屑病發生發展中起至關重要的作用。

中醫藥對銀屑病的治療具有注重整體觀念、辨證施治、副作用小等特點，尚有一定的優勢。中醫學對銀屑病早有“松皮癬、干癬”的記載。情志不暢，而肝失疏泄，“五臟有病，則各傳其所勝”，木旺克土引起土衰，土衰則制水不及而至水盛。脾升胃降，有賴于肝之疏泄，而肝失疏泄則可使脾失健運、水濕內生、郁而化熱、濕熱蘊于肌表而為病。此類患者皮疹潮紅或有糜爛，皮屑多而黏厚，瘙癢無度，兼有脅痛口苦目眩、小便黃赤、飲食不振、脘痞等癥狀。故選用《醫方集解》之龍膽瀉肝湯為基礎方，在此基礎上去木通加以金銀花、土茯苓，其中以龍膽草上清肝經實火、下瀉肝經濕熱，金銀花清熱解毒共為君藥，澤瀉、車前子助龍膽草下瀉肝膽濕熱，黃芩、土茯苓助金銀花清熱解毒，白芍、當歸養血而柔肝，諸藥共用可清肝之實火，瀉肝之濕熱，健脾除濕而消疹。通過現代藥理分析表明，龍膽瀉肝湯加減方具有很多有效成分，作用較為廣泛，主要體現在抗病原微生物、抗炎、調節免疫、抑制表皮細胞增生、止癢、調節代謝障礙以及保肝、利尿等方面[9]。

本研究發現，銀屑病患者皮損處p38MAPK基因與患者外周血中Th17相關細胞因子表達水平明顯增高，其增高程度與患者PASI評分密切相關，說明三者之間相互影響，在銀屑病發生發展以及患者皮損形成過程中起到極其重要的作用。經龍膽瀉肝湯加減方治療后，患者外周血5種細胞因子的表達水平有所下降，同時患者PASI評分也顯著降低，與對照組比較差異有統計學意義，說明龍膽瀉肝湯加減治療銀屑病臨床療效顯著，值得推廣。基于以上研究基礎，可以考慮將銀屑病患者皮損處p38MAPK基因以及外周血中Th17相關細胞因子的檢測作為臨床評估銀屑病嚴重程度及患者預后的檢測指標。

本實驗不足之處只是單純檢測治療前P38MAPK蛋白的表達，因臨床條件及皮損取材所限，無法對銀屑病患者治療后皮損P38MAPK蛋白表達的檢測。在下一步的研究中，希望能通過動物實驗明確龍膽瀉肝湯加減方治療銀屑病的作用機制。

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