乳酸菌發酵產維生素B1和B6的研究

常若毅，呂嘉櫪，余芳

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

維生素是動物體和人類生命活動所必需的一類物質，當機體從外界攝取的維生素不能滿足其生命活動的需要時，就會引起新陳代謝功能的紊亂，導致生病甚至死亡[1]。維生素B1和維生素B6作為食品添加劑，同時又是營養強化劑，在調味品行業有著廣泛的應用[2]。

國內在乳酸菌產B族維生素方面的研究有報道，其中鄧麗、李龍柱、肖平等[3-5]研究表明定植于腸道中的益生菌能產生VB1，VB2，VB6等各種維生素；張開屏、李俊芳等[6,7]篩選鑒定了保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌等乳酸菌發酵產VB6和VB12，其中VB6可達32.62 g/100 L。國外Le Blanc等[8]研究發現乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸性乳酸等為發酵劑時，增加了葉酸和視黃醇的產量；Hou等[9]研究表明雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌ST5、瑞士乳酸桿菌R0052為發酵劑時，提高了維生素B1的含量； Champagne等[10]研究發現

乳酸菌發酵豆奶，維生素B1或B6含量沒有明顯變化。

本文研究的是乳酸菌代謝產維生素。試驗選用10株乳酸菌分別在MRS肉湯培養基、鮮牛乳培養基和蔬菜汁培養基中培養，研究它們在發酵過程中B1和B6的產量。對B族維生素進行粗提等一系列操作，進一步為復合維生素的食品添加劑和營養強化劑的研制提供理論和技術依據。

1 實驗材料和方法

1.1 供試菌種

保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus，LB)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，LA)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，LP)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis，BL)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，LCR)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei，LCP)、糞鏈球菌 (Streptococcusfaecalis，SF)、嗜熱鏈球菌 (Streptococcusthermophilus，ST)、干酪乳桿菌 (Lactobacilluscasei，LC)、羅伊氏乳桿菌 (Lactobacillusreuteri，LR)，由陜西科技大學食品與生物工程學院微生物研究室提供。

1.2 試驗原料

油麥菜、萵筍、芹菜、荸薺、菊芋，市售；鮮牛乳，市售，鮮牛乳符合國家標準[11]。

1.3 試劑藥品

甲醇(色譜純)、VB1標準品(色譜純)、VB6標準品(色譜純)、磷酸二氫鉀(分析純)、鹽酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)。

1.4 培養基配制

1.4.1 MRS液體培養基

牛肉膏 10 g，磷酸氫二鉀 2 g，蛋白胨 10 g，乙酸鈉 5 g，葡萄糖 20 g，檸檬酸二銨 2 g，酵母浸粉 5 g，七水硫酸鎂 0.58 g，硫酸錳 0.25 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水 1000 mL。

1.4.2 鮮牛乳培養基

將鮮牛乳分裝入厭氧管中，每管裝15 mL左右，置于高壓滅菌鍋中滅菌，115 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫。

1.4.3 蔬菜培養基

分別選取5種蔬菜，除去雜物，徹底清洗干凈，使蔬菜和水的比例是2∶1，用打漿機榨汁，過100目篩，115 ℃滅菌15 min，備用。

1.5 儀器設備

1525-2487型高效液相色譜儀 美國Waters公司；DM750型LEICA數碼顯微鏡 北京瑞科中儀科技有限公司；QSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；PHS-3C型pH計 北京賽多利斯天平有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DH-360型電熱恒溫培養箱 北京科偉永興儀器有限公司。

1.6 實驗內容及方法

1.6.1 菌種活化

將MRS液體培養基分裝入厭氧管中，每管裝15 mL左右，置于高壓滅菌鍋中滅菌121 ℃，15 min，冷卻至室溫。然后接入菌種，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。將火化后的菌種放于4 ℃冰箱中保存備用。

1.6.2 10株乳酸菌在MRS培養基中產VB1和VB6的研究

10株乳酸菌按1%的接種量接種到MRS液體培養基中，在37 ℃條件下靜置培養48 h時，離心，取上清液，測定VB1和VB6含量。

1.6.3 10株乳酸菌發酵鮮乳產VB1和VB6的研究

10株乳酸按1%的接種量接種到鮮牛乳培養基中，在37 ℃下靜置培養至凝乳，離心，取上清液，測定VB1和VB6含量。

1.6.4 10株乳酸菌發酵不同蔬菜產VB1和VB6的研究

10株乳酸菌按1%的接種量接種到不同的蔬菜中，在37 ℃下靜置培養48 h，離心，取上清液，進行測定VB1和VB6含量。

1.7 VB1和VB6測定方法

VB1和VB6的測定采用高效液相色譜法[12]。

1.7.1 標準儲備液的制備

準確稱取VB1和VB6標準品各0.010 g于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶解并定容至刻度，配成質量濃度均為1 g/L的VB1和VB6標準儲備液。

1.7.2 色譜條件

色譜柱：C18(配有紫外檢測器)，流動相：0.05 mol/L KH2PO4(pH 6.0)-甲醇(體積比85∶15)，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，波長：265 nm，進樣量：20 μL。

1.7.3 標準曲線的繪制

分別配制質量濃度為10～50 mg/L的2種維生素標準溶液，在b所述的條件下進樣測定，得到2種維生素的峰面積A與質量濃度C(mg/L)的線性關系。

1.7.4 樣品處理

取5 mL發酵液，并加入40 mL的0.1 mol/L鹽酸超聲混合均勻。再用0.1 mol/L鹽酸定容至50 mL，超聲混勻后，靜置，離心后取上清液，獲得VB1和VB6的提取液，提取液過0.45 μm水系濾膜后上機測定。

1.7.5 標準品圖譜

VB1和VB6標準品在上述色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖。

圖1 50 mg/L VB1標準品溶液的高效液相色譜圖

圖2 50 mg/L VB6標準品溶液的高效液相色譜圖

由圖1和圖2可知，在上述色譜條件下VB1的保留時間為2.804 min。VB6的保留時間為5.088 min。取VB1和VB6的標準品儲備液，分別配制10～50 mg/L質量濃度梯度的2種B族維生素標準溶液，在色譜條件下分別測定，選取以B族維生素濃度C(mg/L)為橫坐標、以峰面積A為縱坐標線性回歸，獲得回歸方程，見表1。

表1 VB1和VB6 的線性回歸方程、相關系數、線性范圍

1.7.6 VB1和VB6混標譜圖

圖3 VB1和VB6混合標準液高效液相色譜圖

2 結果與討論

2.1 10株乳酸菌發酵MRS培養基VB1和VB6含量

以10株乳酸菌為發酵菌種，接種到MRS培養基中發酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結果見圖4。

圖4 10株乳酸菌發酵MRS培養基 VB1和VB6的含量

由圖4可知，10株乳酸菌發酵MRS培養基均產生VB1和VB6。其中，10株乳酸菌發酵液中VB1濃度在1.02～2.37 mg/L之間，VB6濃度在0.35～5.32 mg/L之間。ST發酵產VB1最大，為2.37 mg/L；LA發酵產VB6最大，為5.32 mg/L。

2.2 10株乳酸菌發酵乳VB1和VB6含量

以10株乳酸菌為發酵菌種，接種到鮮乳培養基中發酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結果見圖5。

圖5 10株乳酸菌發酵乳VB1和VB6的含量

由圖5可知，10株乳酸菌發酵乳中均產生VB1和VB6。其中，發酵乳中VB1濃度在0.32～1.38 mg/L之間，VB6濃度在0.56～2.85 mg/L之間。LC發酵乳中VB1含量最高，為1.38 mg/L；LB發酵乳中VB6含量最高，為2.85 mg/L；10株菌在牛乳中發酵VB1產量小于在MRS培養基中發酵，LB，BL，ST，SF在牛乳中發酵VB6產量高于在MRS培養基中發酵。

2.3 10株乳酸菌發酵蔬菜VB1和VB6含量

2.3.1 10株乳酸菌發酵萵筍VB1和VB6的測定

以10株乳酸菌為發酵菌種，接種到萵筍培養基中發酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結果見圖6。

圖6 10株乳酸菌發酵萵筍VB1和VB6的含量

由圖6可知，10株乳酸菌發酵萵筍中均產生VB1和VB6。發酵萵筍中VB1含量在9.13～10.34 mg/L之間，VB6含量在16.56～19.78 mg/L之間。LA發酵萵筍時，VB1含量最高；ST發酵萵筍時，VB6含量最高。10株乳酸菌發酵萵筍產VB1的量基本一致。乳酸菌發酵蔬菜汁比發酵鮮牛乳和MRS培養基中維生素產量高出很多。

2.3.2 10株乳酸菌發酵芹菜VB1和VB6的測定

以10株乳酸菌為發酵菌種，接種到芹菜培養基中發酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結果見圖7。

圖7 10株乳酸菌發酵芹菜VB1和VB6的含量

由圖7可知，10株乳酸菌發酵芹菜中均產生VB1和VB6。10株乳酸菌發酵芹菜時，VB1含量在8.43～9.75 mg/L，VB6含量在13.78～17.39 mg/L。LCR發酵芹菜汁VB1含量最大；LA發酵芹菜汁VB6含量最大。10株乳酸菌發酵芹菜產VB1的量基本一致。乳酸菌發酵芹菜VB1，VB6含量都低于發酵萵筍VB1，VB6含量。

2.3.3 10株乳酸菌發酵油麥菜VB1和VB6的測定

以10株乳酸菌為發酵菌種，接種到油麥菜培養基中發酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結果見圖8。

圖8 10株乳酸菌發酵油麥菜VB1和VB6的含量

由圖8可知，10株乳酸菌發酵油麥菜中均產生VB1和VB6。10株乳酸菌發酵油麥菜時，VB1含量在9.04～10.89 mg/L之間，VB6含量在16.72～20.31 mg/L之間。LA發酵油麥菜上清液中VB1，VB6含量都最大。10株菌發酵油麥菜VB6產量大于發酵芹菜的產量。除了菌種LCR，其余菌株發酵油麥菜產VB1的量均高于在芹菜中發酵的產量。

2.3.4 10株乳酸菌發酵荸薺VB1和VB6的測定

以10株乳酸菌為發酵菌種，接種到荸薺培養基中發酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結果見圖9。

圖9 10株乳酸菌發酵荸薺VB1和VB6的含量

由圖9可知，10株乳酸菌發酵荸薺中均產生VB1和VB6。VB1含量在8.56～10.11 mg/L之間，VB6含量在13.28～17.44 mg/L之間。LC發酵荸薺時VB1含量最高；LA發酵荸薺時VB6含量最高。

2.3.5 10株乳酸菌發酵菊芋VB1和VB6的測定

以10株乳酸菌為發酵菌種，接種到菊芋培養基中發酵48 h后分別測定 VB1和VB6的含量，結果見圖10。

圖10 10株乳酸菌發酵菊芋VB1和VB6的含量

由圖10可知，10株乳酸菌發酵菊芋均產生VB1和VB6。VB1含量在8.56～9.98 mg/L之間，VB6含量在13.43～17.87 mg/L之間。LA菌株發酵菊芋時，VB1和VB6都最高。LB，LC，ST，SF，LCR，LR在菊芋中發酵VB1的產量低于在荸薺中發酵的產量，ST，LCR，LR在菊芋中發酵VB6的產量低于在荸薺中發酵的產量，其余菌株VB6的產量高于在荸薺中發酵的產量。

3 結論

10株乳酸菌發酵MRS培養基、鮮牛乳和5種蔬菜均產生VB1和VB6。10株乳酸菌在MRS培養基中的維生素B1含量在1.02～2.37 mg/L，維生素B6含量在0.35～5.32 mg/L；在發酵乳中的維生素B1的含量在0.32～1.38 mg/L，維生素B6含量在0.56～2.85 mg/L；在不同的發酵蔬菜汁中維生素B1的含量在8.43～10.89 mg/L，維生素B6的含量在13.28～20.31 mg/L。乳酸菌發酵蔬菜VB1和VB6的產量大于發酵MRS培養基和發酵乳的維生素產量。

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