己酸菌培養條件和不同微生物對己酸菌生長代謝影響的研究

劉英杰，張志偉，韓墨，楊平平，王燕

(齊魯工業大學 生物工程學院，濟南 250353)

在窖泥中己酸菌數量的多少決定了窖泥功能的強弱，直接影響濃香型大曲酒質量的優劣。由于己酸菌的生存、生長、繁殖、代謝都有其自身的規律，只有不斷地研究其規律，發現影響己酸菌生長繁殖代謝的主要因素，創造適宜己酸菌生長繁殖代謝的生態環境，才能提高窖泥中的己酸菌數量，從而為提高濃香型白酒質量奠定基礎。

1 己酸菌的形態特征

1.1 己酸菌的菌落特征

筆者分離出1株己酸菌，菌落呈現乳白色圓形，周圍有透明圈，菌落邊緣不規則，見圖1。

圖1 己酸菌的形態特征

彭兵等[1]采用乙醇醋酸鈉培養基對分離出的高產己酸菌株進行形態觀察發現，菌落呈白色圓形、扁平、表面光滑，且菌落周圍有較為明顯的透明圈。侯小歌等[2]從白酒糟醅中分離出的己酸菌較大，圓形、透明、乳黃色。菌落呈現不同顏色可能是己酸菌來源不同，己酸菌的種群結構存在差異。

1.2 己酸菌的個體特征

己酸菌是生活在土壤中的棒狀芽孢桿菌，長1.94～3.35 μm，寬0.51～0.75 μm，革蘭氏染色陽性，適宜生活在pH為4.0～6.5的中性偏酸的環境中，游離孢子呈圓形，長0.15～0.18 μm。徐軍等[3]從枝江老窖泥中分離出1株己酸菌，該菌體呈短桿狀(0.6～0.7) μm×(3.5～4.5) μm，兩頭膨大成鼓槌狀。與筆者從窖泥中分離出的己酸菌個體形態相同。

2 不同培養條件對己酸菌株數量、產酸的影響

2.1 碳源對己酸菌產酸的影響

己酸菌發酵所需的碳源主要來自于酵母發酵糖類產生的酒精和被其他微生物代謝生成的有機酸，所以維持酵母和霉菌等的適當營養，使之為己酸菌提供適量的乙醇和酸類等，則可以有效地促進己酸菌的生長代謝[4]。謝彪等[5]在乙酸鈉培養基中分別添加2.5%的乙酸、淀粉水解糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、乳酸代替乙醇作為碳源，其他成分不變，相同條件下培養10天后，結果發現：用乙醇產己酸最多，可以達到20.3 g/L，葡萄糖產生的己酸量次之，為4.8 g/L。說明乙醇是己酸菌產己酸最好的碳源。

韓珍瓊等[6]探究了乙醇濃度對己酸菌生長情況的關系，只改變培養液中乙醇濃度，33 ℃培養6天，觀察己酸菌的個體形態發現：乙醇濃度在2%～3%范圍內，菌數較多，生長良好；在其他范圍內，己酸菌很少甚至沒有，而且菌體也很小。說明適宜的乙醇濃度對己酸菌正常的生長至關重要。

在實際生產中，根據各地域的不同，調整一個合適的糧糟比，使入窖淀粉含量維持在15%～17%之間，其滿足己酸菌和其他微生物所需的碳源[7]。

2.2 氮源對己酸菌株產己酸的影響

氮源是組成己酸菌細胞內蛋白質和核酸的重要元素，這2種物質又是微生物生命活動中不可缺少的物質，因此氮源對維持己酸菌自身的生長增殖非常重要[8]。

利用乙酸鈉改良培養基，任靜等[9]探究了L-亮氨酸和L-賴氨酸作氮源對己酸菌產己酸能力的影響，數據顯示：上述2種氮源含量分別在0.2%和0.1%時產己酸最多；馬業準[10]也探究了L-亮氨酸和L-賴氨酸作氮源對己酸菌產己酸能力的影響，結果顯示：培養基中添加0.2%的L-亮氨酸或L-賴氨酸，己酸量增多。推測上述2種氨基酸有可能是除了起到氮源作用外，同時作為己酸菌的生長因子，促進了己酸菌產酸。

2.3 溫度對己酸菌發酵的影響

己酸菌的營養細胞最適宜的生長溫度在35 ℃左右。在適宜的溫度范圍內己酸菌可以被快速地激活、繁殖及代謝。溫度過低會抑制生長代謝，過高則會導致早衰死亡。

謝彪等采用乙酸鈉培養基，研究發酵溫度對產酸的影響，控制溫度為25，27，30，33，35，40，45 ℃發酵9天后，對發酵液進行己酸分析。結果表明：己酸產量隨著溫度的上升先增加后下降，發酵的最適溫度為35 ℃，己酸產量達到19 g/L。

在濃香型大曲酒的發酵過程中要根據當地的氣候，通過控制糧糟比、糧水比、量水溫度、入池溫度等工藝參數來控制發酵溫度在29～36 ℃，為釀酒微生物提供一個適宜的生長代謝環境。

2.4 VC對己酸產量的影響

馬榮山等[11]探究了VC對發酵液中的己酸產量的影響，實驗表明：發酵液中添加VC會增加己酸的含量，原因是己酸菌在培養液里生長一段時間后，產生一定量的己酸，加入醇會酯化生成己酸乙酯；這時由于己酸不斷產生，發酵液pH不斷下降，適宜生長的環境條件遭到破壞，己酸菌進入了衰亡期。加入VC會抑制一部分己酸的酯化反應，延長對數期，從而對己酸生成有促進作用。

2.5 底鍋水對己酸菌產酸的影響

謝國排[12]研究了底鍋水對己酸菌產己酸的影響。當底鍋水添加量從0～30%不斷增加時，己酸產量也依次增加，最高達380 mg/dL，說明底鍋水的加入確實促進了己酸菌的生長代謝。究其原因，是因為底鍋水中含有部分有機質，在己酸菌的生長過程中為其提供營養；此外，有一部分有機質作為己酸菌生長代謝中的前驅物質促進了其代謝活動。該實驗的不足之處在于未探究底鍋水含量高于30%時對己酸菌產酸的影響，是否有可能己酸產量會更高。

2.6 CaCO3含量對己酸菌產酸的影響

謝彪等采用乙酸鈉培養基，CaCO3添加量分別為0，5，10，15，20，25，30 g/L，其他成分不變，發酵10天后，對發酵液進行己酸含量測定。結果表明：CaCO3添加量在0～15 g/L范圍內，己酸生成量逐步增加，在15～30 g/L范圍內，己酸生成量逐步減少，比較得出培養基中CaCO3含量維持在15 g/L，己酸產量最高。

原因是碳酸鈣中的鈣離子不僅為己酸菌的代謝發酵提供了無機營養，調節和緩沖培養基的pH，而且對己酸合成有關的酶活性有一定促進作用。

3 其他微生物對己酸菌生長代謝的影響

3.1 乙酸菌對己酸菌生長代謝的影響

乙酸菌的主要功能是產生乙酸。由于乙酸是酸性較強的有機酸，在糟醅中會使環境的pH值降低，如果產生過量的乙酸，會對己酸菌的生長代謝環境造成影響，會抑制己酸菌的生長代謝過程，嚴重會造成濃香型白酒的酒質微量成分比例失調，質量下降。因此，在實際操作中一定要把糟醅的pH值控制在合適的范圍內，并注意場地衛生，預防乙酸菌的過量繁殖，這對于乙醇的生成和己酸菌的生長都是有利的。

3.2 乳酸菌對己酸菌生長代謝的影響

乳酸菌是一個粗放型菌種，對環境要求不高，生長繁殖能力特別強，繁殖代謝速度快，世代生長周期比己酸菌短，因此，在白酒生產過程中稍有不慎，糟醅就會感染大量的乳酸菌，其發酵糖類產生大量乳酸，一方面使糟醅的pH值下降，阻止己酸菌的生長代謝，導致己酸菌和己酸乙酯的含量下降；另一方面，乳酸長期積累會與窖泥中的鈣、鐵離子結合生成乳酸鈣、乳酸鐵，己酸菌的生長繁殖受到抑制[13]。所以，在濃香型白酒生產過程中都要采取“增己降乳”的技術措施來提高濃香型白酒的質量。

3.3 甲烷菌對己酸菌的影響

己酸菌在生長和代謝中會產生對自身有毒害作用的H2和CO2，甲烷菌則利用氫作能源，CO2作碳源，消除己酸菌代謝的反饋抑制作用[14]。因此甲烷菌是己酸菌生活的合格環境清潔工，它的存在使窖內各種產 H2型發酵得以有效進行。實踐證明：在人工老窖泥中，可以添加一定量的并具有良好共生作用的甲烷菌，使之成為窖泥中有益的功能菌，促進己酸菌的生長繁殖。

3.4 放線菌對己酸菌的影響

放線菌是一種固氮微生物，可以將分子氮轉變為氨態氮，為己酸菌等微生物提供一定的氮源，實驗表明：在己酸菌培養時，添加適量的放線菌對促進己酸菌活菌數的增長有顯著的作用[15]。

4 結論與展望

己酸菌適宜培養條件：培養溫度35 ℃，乙醇作碳源產己酸最多，pH值為5～7，酒精濃度2%～3%，CaCO3添加量15 g/L；培養基中添加VC、底鍋水可以有效提高己酸產量；過量乳酸菌對己酸菌有抑制作用，濃香型白酒的生產中強調“增己降乳”，放線菌可為己酸菌生長提供氮源。掌握己酸菌適宜的生長環境，供給豐富、適當的營養，創造對己酸菌有益的微生物菌群，對己酸和己酸乙酯的形成大有裨益，進而為科研和生產提供理論指導，促進己酸菌的科學應用。

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