響應面法優化美味牛肝菌揮發性風味物質的萃取工藝

郭磊，肖志暉，李鵬，闞歡，劉云

(西南林業大學西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，昆明 650224)

美味牛肝菌(Boletusedulis)，別名白牛肝菌、大腳菇，屬真菌界(Fungi)，真菌門(Eumycota)，擔子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricales)，牛肝菌科(Boletaceae)，牛肝菌屬(Boletus)[1]。美味牛肝菌含有蛋白質、脂肪、黃酮類化合物、三萜類化合物、多糖等多種營養成分[2-6]，而提取物具有抗氧化、抗腫瘤以及免疫調節等藥理活性[7]。在北美洲、歐洲北至斯堪的納維亞半島，南到希臘、意

大利的大部分地方、拉丁美洲的墨西哥以及整個亞洲均有分布[8]，中國是美味牛肝菌的主要分布區域，在云南有廣泛分布[9]。

食用菌的揮發性香氣成分主要包括揮發性八碳化合物、含硫化合物以及醛、酸、酮、酯類等，其中揮發性八碳化合物是食用菌最重要的風味物質[10]。香味物質在食品中含量很低，一般在ppb水平[11]。常用的食品風味物質的提取方法有溶劑萃取法、常規水蒸氣蒸餾法、超臨界萃取法、頂空收集法、同步蒸餾萃取法及固相微萃取法[12]。同時蒸餾萃取法(SDE)是一種提取、分離和富集試樣中揮發性、半揮發性成分的有效方法[13]，廣泛應用于食品分析、香精香料、藥物化學等行業的樣品分析前處理中[14]。常用的有機溶劑有正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙醋、正戊烷等。

近年來，隨著生活水平和消費需求的不斷提高，人們已經不再滿足于大眾化的調味品，更加偏好于風味獨特的調味料，這對調味品行業的發展提出了更高的要求，美味牛肝菌風味獨特，營養價值高，可開發出滿足廣大消費者需求的新型天然調味料。目前對美味牛肝菌及其加工制品的風味組成及變化的研究鮮見報道。

本研究通過同時蒸餾萃取法對美味牛肝菌干制品進行揮發性風味物質的提取，并通過Box-Benhnken響應面分析法優化風味物質的萃取條件，為研究云南美味牛肝菌的風味成分并進一步為研發天然牛肝菌調味品提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國 Agilent 科技有限公司；同時蒸餾萃取裝置(定制)；RE-52A 旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理與同時蒸餾萃取

云南美味牛肝菌在35 ℃下烘6 h，超微粉碎后過50目篩備用。

準確稱取一定量的菌粉，放入SDE裝置的1000 mL圓底燒瓶中，加入一定量的蒸餾水和氯化鈉并混合均勻，加熱至沸騰。裝置另一端的圓底燒瓶盛放一定量的正己烷溶液，放于水浴鍋中，兩端同時加熱進行蒸餾萃取。一定時間后，降至室溫置于旋轉蒸發儀進行濃縮除去正己烷，稱重計算提取量。

1.2.2 單因素實驗

以正己烷為萃取溶劑，以揮發性風味物質萃取量為實驗指標，研究萃取時間(h)、萃取溫度(℃)、溶劑加入量(mL)、料液比(g/mL)等因素對云南美味牛肝菌揮發性風味物質萃取量的影響。因素水平如下：固定萃取溫度75 ℃，溶劑加入量50 mL，料液比1∶40(g/mL，下同)，考察不同的萃取時間(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h)對萃取量的影響；固定萃取時間1h，溶劑加入量50 mL，料液比1∶40(g/mL)，考察不同的萃取溫度(60，65，70，75，80 ℃)對萃取量的影響；固定萃取時間1 h，萃取溫度75 ℃，考察不同的溶劑加入量(30，40，50，60，70 mL)對萃取量的影響；固定萃取時間1 h，萃取溫度75 ℃，溶劑加入量50 mL，考察不同的料液比(1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50)對萃取量的影響。

從現場變形跡象來看：后緣以連續拉張裂縫、錯落坎等變形跡象為主，局部出現坍滑現象，該工程邊坡后緣風化巖體剝離，主要受優勢節理裂隙影響，目前整體邊坡無大變形跡象。

1.2.3 Box-Benhnken中心組合試驗設計

在單因素實驗結果的基礎上，選擇影響萃取量較大的3個因素如萃取時間(h)、溶劑加入量(mL)、料液比(g/mL)為研究對象，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計的原理，采用三因素三水平響應曲面分析方法，以萃取量為響應值，試驗因素與水平的設計見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

1.2.4 數據處理

采用F檢驗對獲得的數據進行方差分析并評價模型的統計意義，數據分析軟件采用Design Expert 6.0.5。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 時間對萃取量的影響

圖1 時間對萃取量的影響Fig.1 Effect of time on the extraction content

由圖1可知，美味牛肝菌揮發性風味物質的萃取量隨著時間的延長先增加后減少，在萃取時間為1 h時達到最大，隨后逐漸減少。隨著萃取時間的增加，風味物質被萃取得比較完全，但當時間延長，由于本身的揮發造成損失的作用越來越大，含量逐漸減少。因此，最適萃取時間為1 h。

2.1.2 溫度對萃取量的影響

圖2 溫度對萃取量的影響Fig.2 Effect of temperature on the extraction content

由圖2 可知，隨著溫度的升高，美味牛肝菌揮發性風味物質的萃取量先增加后趨于平衡，在溫度為75 ℃時達到最大。隨著溫度的升高，正己烷由于達到自身沸點能夠較好地萃取出揮發性風味物質，但溫度的持續升高，正己烷蒸發過快造成萃取量稍稍減少，甚至部分物質性質不穩定而發生化學變化。因此，最適萃取溫度為75 ℃。

2.1.3 溶劑加入量對萃取量的影響

圖3 溶劑加入量對萃取量的影響Fig.3 Effect of solvent volume on the extraction content

由圖3可知，隨著溶劑加入量的不斷增加，美味牛肝菌揮發性風味物質的萃取量先增加后減少，當溶劑加入量為50 mL時達到最大。溶劑加入量增大會萃取更多的揮發性風味物質，但溶劑加入量過多，后期的旋轉蒸發時間也較長，可能帶出較多的風味物質，不利于收集。因此，最適溶劑加入量為50 mL。

2.1.4 料液比對萃取量的影響

圖4 料液比對萃取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction content

由圖4可知，隨著固液比的增加，美味牛肝菌揮發性風味物質的萃取量先增加后減少，在固液比為1∶40時達到最大。固液比的增加會增大樣品間的疏散性，使得萃取量有較大增加，但固液比超過一定的值后，揮發性風味物質可能一部分溶在熱水里而造成萃取量下降。因此，最適固液比為1∶40。

2.2 響應面實驗

2.2.1 響應面實驗方案及結果

在單因素結果的基礎上，由 Design-Expert 6.0.5設計出的實驗方案及結果見表2，以揮發性風味物質的萃取量為響應值，以影響萃取量較大的3個因素萃取時間(A)、 溶劑加入量(B)、 料液比(C)為自變量，建立三因素三水平的中心組合實驗設計，實驗結果，見表2。

表2 Box-Benhnken實驗設計及其實驗結果Table 2 Box-Benhnken test design and results

續 表

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析

采用Design-Expert 6.0.5對所得的實驗數據進行回歸分析，結果見表3，對各因素進行回歸擬合后得回歸方程：

Y=-20.37+5.61A+0.03B+1.03C-1.66A2-0.0014B2-0.01C2+0.0023AB-0.02AC+0.0029BC。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

注：**，P<0.01為極顯著；*，P<0.05為顯著。

回歸模型的R2=0.7531，RAdj2=0.9487，可知回歸方程模型極顯著(p<0.0001)，該模型與實際擬合良好，實驗方法可靠，失擬項不顯著(p>0.05)，所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，可用此回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。結果表明C，A2，B2，C2，BC對響應值影響顯著。

2.2.3 響應面圖分析

對二次多項回歸方程所做的相應曲面圖見圖5。通過三組動態圖可對任何兩因素交互影響萃取效應進行分析與評價，并確定最佳因素范圍。

圖5 兩因素的交互作用對多糖得率的響應面圖Fig.5 The interaction of the two factors on the response surface of polysaccharide yield

圖5分別顯示了萃取時間、溶劑加入量、料液比為零水平時，萃取時間(h)和溶劑加入量(mL)、萃取時間(h)和料液比(g/mL)、溶劑加入量(mL)與料液比(g/mL)對美味牛肝菌揮發性風味物質萃取量的交互影響效應。3個圖中萃取量都隨任意2個變量的增加呈上升趨勢，達到某一定值時，曲面稍下降或趨于平緩。

2.2.4 驗證實驗

對回歸方程進行求解，即萃取量最大值時的萃取條件為萃取時間1.46 h、溶劑加入量56.48 mL、料液比1∶42.28(g/mL)，最大萃取量達到6.27 mg/g，為方便實際操作將實驗條件定為萃取時間1.5 h、溶劑加入量55 mL、料液比1∶40。取3等份美味牛肝菌粉進行平行實驗，所得平均萃取量為5.98 mg/g，經回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合，證明此響應面法可以有效優化美味牛肝菌揮發性風味成分的萃取工藝。

3 結論

目前，市場上的食用菌類調味品逐漸增多，但大多為干制油炸等粗加工產品，生產工藝簡單，生產的調味料中食用菌的鮮香味營養成分物質未被充分釋放出來[15]。美味牛肝菌具有獨特的鮮香氣味，將其做成風味獨特、香味濃郁的天然調味品或者天然復合風味調料必定有著廣闊的市場前景。

美味牛肝菌是具有云南特色的優勢資源，本文采用同時蒸餾萃取法對美味牛肝菌的揮發性風味物質進行萃取，建立了美味牛肝菌揮發性風味物質的萃取回歸模型，并優化出揮發性風味物質的萃取工藝條件。為分析美味牛肝菌揮發性風味成分的釋放規律及進一步開發出美味牛肝菌復合調味料提供了一定的技術條件，具有一定的實用價值。

[1]卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州:河南科學技術出版社,2000.

[2]冮潔,李學偉,金懷剛.美味牛肝菌菌絲體與子實體蛋白質營養價值的評價[J].食品科學,2013,34(3):253-256.

[3]李志洲.美味牛肝菌中油脂成分的提取及其成分分析[J].氨基酸和生物資源,2009,31(2):17-20.

[4]崔福順,張華,李官浩,等.美味牛肝菌黃酮類提取物體內抗氧化作用研究[J].食品科技,2014,39(8):201-205.

[5]崔福順,崔泰花.美味牛肝菌總三萜提取及大孔樹脂純化工藝研究[J].延邊大學農學學報,2014,36(3):252-257.

[6]萬國福.響應面法優化美味牛肝菌多糖提取工藝研究[J].食品工程,2011,23(6):160-162.

[7]何容,劉紹雄,劉春麗,等.美味牛肝菌研究進展[J].食品與發酵科技,2016,52(4):75-77,82.

[8]Hall I R,Lyon A J E,Wang Y,et al.Ectomycorrizal fungi with edible fruiting bodies-2.Boletusedulis[J].Economic Botany,1998,52(1):44-56.

[9]趙永昌,方琳,張荀,等.云南美味牛肝菌ITS區域結構特點[J].云南植物研究,2006,28(6):575-580.

[10]李巍巍,吳時敏,徐婷.褐黃牛肝菌揮發性風味物質組成研究[J].上海交通大學學報(農業科學版),2009,27(3):300-304.

[11]Deborah Roberts,Hugues Brevard.Isolation and concentration of aroma compounds[M].Berlin:Akademie Verlag,2002.

[12]黃雯.香菇風味物質研究及酶解香菇技術探索[D].杭州:浙江大學,2012.

[13]劉洋,張寧,徐曉蘭,等.SDE/GC-MS分析火鍋底料的揮發性風味成分[J].中國食品學報,2014,14(2):283-291.

[14]高蕾,陳愷,周建中,等.響應面法優化同時蒸餾法萃取熏馬腸中揮發性風味物質的研究[J].食品工業科技,2016,37(6):52-57.

[15]張曉艷,孫敏杰,劉丹,等.關于食用菌調味料分類的討論[J].北京農業,2011(1):26-27.