紅曲高產洛伐他汀低產桔青霉素的研究

張江寧，王娟娟，張俊杰，楊春

(1.山西省農業科學研究院農產品加工研究所，太原 030031；2.山西大學，太原 030031)

紅曲是紅曲霉發酵制成的產品的總稱，國內外大量研究表明由于紅曲含有洛伐他汀成分，因此具有明顯的降膽固醇和降血脂的功效，與傳統中成藥、魚油類、亞麻酸類相比，在治療效果上更勝一籌[1]，起效迅速，而且具有生產成本低、食用方便等優點。但是紅曲霉發酵過程中產生的桔青霉素是對人體有害的真菌毒素[2]，靶器官為人體腎臟，具有致癌致畸作用，因此，紅曲產品中桔青霉素的含量問題引起了廣泛的關注[3]。國外一些國家早已將紅曲產品中的桔青霉素含量作為食品污染的嚴格控制指標，這使我國紅曲產品的出口

受到了很大的限制，桔青霉素問題已成為我國紅曲產品出口的瓶頸[4]，如何通過工藝革新提高洛伐他汀、降低桔青霉素含量是亟待研究的課題[5]。本實驗建立了洛伐他汀、桔青霉素的高效液相色譜檢測方法，并在此基礎上研究6種不同發酵基質對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響，旨在研究適合生產紅曲米的優質培養基，在實現紅曲保健功能作用的同時，避免毒副作用和不良反應的發生，保證紅曲藥用和食用的安全性。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

安卡紅曲：實驗室保藏，甲醇、磷酸、95%乙醇洛伐他汀、桔青霉素、乙醇提取液(75%)、乙腈、磷酸、甲醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、復合萃取劑(TEF)：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(7∶3∶1)，將7份體積的甲苯、3份體積的乙酸乙酯和1份體積的甲酸混合而成。

SW-CJ-2G 超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；GMSX-280高壓滅菌鍋 上海博迅有限公司；LG10-2.4離心機 北京醫用離心機廠；高效液相色譜儀：DIONEX UltiMate 3000 UHPLC+focused，配備泵RS Pump，自動進樣器RS Autosampler，柱溫箱RS Column Compartment，檢測器 Diode Array Detector；Thermo Scientific Q Exactive高分辨質譜儀； SHZ-D(III)不銹鋼循環水式真空泵 北京醫用離心機廠；JY92-ⅡN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試驗方法[6]

1.2.1 PDA瓊脂斜面培養基

稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛(煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可)，用4層紗布過濾，再加葡萄糖和瓊脂各20 g，繼續加熱攪拌混勻，稍冷卻后加入檸檬酸1 g，再補足水分至1000 mL，分裝試管，加塞、包扎，121 ℃滅菌20 min后取出，試管擺斜面，冷卻后貯存備用[7]。

1.2.2 固態發酵培養基及紅曲米制備[8]

原料20 g分別裝入250 mL三角瓶中，經清洗，放置于0.25%的檸檬酸水用蒸鍋蒸熟，蒸至物料顆粒分散、微粘狀態，分別裝入250 mL三角瓶中，加自來水適量，包扎，121 ℃滅菌30 min。紅曲米制作：挑取1環保藏菌種接種于斜面培養基中，于 31 ℃恒溫箱中擴大培養1周，試管表面加無菌生理鹽水，稀釋制成孢子濃度約為106～107個/mL的懸液。以每瓶10 mL孢子懸液接種于固體發酵培養基中，30 ℃培養6天。每天翻曲，并根據情況加pH 4的檸檬酸水。

1.2.3 不同固態發酵基質紅曲米感官評價及對洛伐他汀、桔青霉素含量的影響[9]

取大米、小米、黑小米、燕麥米、苦蕎麥仁、高粱20 g分別裝入250 mL三角瓶中，其余方法同1.2.2，制成紅曲米[10]，進行感官評價并測定洛伐他汀及桔青霉素含量[11,12]。

2 結果與討論

2.1 洛伐他汀UHPLC測定方法的建立[13]

2.1.1 發酵樣品處理[14,15]

將發酵樣品碾磨烘干過40目篩，取0.5 g于50 mL比色管中，用70%乙醇溶液定容到50 mL，55 ℃水浴萃取1 h，每隔20 min震蕩1次，水浴結束后冷卻至室溫，取5 mL萃取液微濾。

2.1.2 UHPLC條件

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，流動相A為純水，流動相B為乙腈，流速0.200 mL/min，流動相梯度設置：0 min，5% B；1 min，5% B；8 min，95% B；15 min，95% B；15.01 min，5% B；18 min，5% B。柱溫：35 ℃，檢測波長238 nm，進樣量：2 μL。

2.1.3 標準曲線的繪制及洛伐他汀標準品及發酵樣品譜圖[16,17]

標準曲線的配制：準確稱取0.002 g的洛伐他汀標準品于100 mL容量瓶中，用色譜甲醇溶解并定容，制成20 mg/L的洛伐他汀標準儲備液。取一定量的儲備液用甲醇稀釋后配制成質量濃度10，5，2，1，0.5，0.1，0.05 mg/L的標準工作液用于制標準曲線。將標準溶液注入液相色譜儀中，以保留時間結合其質譜精確質量數定性，洛伐他汀標準品與以小米為基質功能紅曲的UHPLC-MS圖見圖1。根據標品的保留時間可以判斷，洛伐他汀出峰時間為10 min，其質譜精確分子量為427.24550，對應為其分子的加鈉峰[M+Na]+。以洛伐他汀標準品質量濃度(mg/L)與相對應的質譜峰面積(Y)繪制標準曲線見圖2，獲得線性回歸方程及相關系數。

圖1 洛伐他汀標準品與以小米為基質功能紅曲的UHPLC-MS圖Fig.1 UHPLC-MS spectrum of lovastatin standard sample and functional monascus with millet as substrate

圖2 洛伐他汀標準曲線Fig.2 Standard curve of lovastatin

2.2 桔青霉素含量測定方法[18]

2.2.1 發酵樣品處理

用電子天平準確稱取一定量固態紅曲樣品6 g于100 mL具塞比色管中，加入40 mL TEF溶液，超聲提取10 min(強度40%，工作5 s，間隔5 s)3000 r/min離心20 min,上清液轉入250 mL具塞三角瓶中，殘渣用30 mL TEF溶液同上述步驟再提取2次，合并3次提取上清液于250 mL具塞三角瓶中，40 ℃真空濃縮至干后加入60 mL甲醇溶解，經微孔有機濾膜過濾后進行HPLC分析。

2.2.2 UHPLC檢測條件

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)，流動相A為純水，流動相B為乙腈，流速0.200 mL/min，流動相梯度設置：0 min，5% B；1 min，5% B；8 min，95% B；15 min，95% B；15.01 min，5% B；18 min，5% B。柱溫：35 ℃，檢測波長:238 nm，進樣量：2 μL。

2.2.3 標準曲線的繪制及桔青霉素標準品及發酵樣品譜圖[19]

桔青霉素標準溶液：準確稱取0.002 g的桔青霉素標準品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成20 mg/L的桔青霉素標準儲備液。取一定量的儲備液用甲醇稀釋2倍，制成10 mg/L的標準工作液。儲備液和工作液密封后于4 ℃冰箱閉光保存，工作液現用現配。工作液從冰箱取出后室溫下放置10 min。將工作液用甲醇稀釋后配制成質量濃度5，1，0.25，0.1 mg/L的標準工作液用于制標準曲線。分別將不同質量濃度20，10，5，1，0.25，0.1 mg/L的桔青霉素標準溶液注入液相色譜儀中，以保留時間結合其質譜精確質量數定性，桔青霉素標準品與以小米為基質功能紅曲的UHPLC-MS譜圖見圖3。根據標品的保留時間可以判斷，桔青霉素出峰時間為6.26 min，其質譜精確分子量為251.09140，對應其加氫形式[M+H]+。以桔青霉素質量濃度與相對應的峰面積繪制標準曲線見圖4，獲得線性回歸方程及相關系數，以此計算樣品中桔青霉素含量。

圖3 桔青霉素標準品及以小米為基質功能紅曲的UHPLC-MS圖Fig.3 UHPLC-MS spectrum of citrinin standard sample and functional monascus with millet as substrate

圖4 桔青霉素標準曲線Fig.4 Standard curve of citrinin

2.3 不同發酵基質紅曲米感官評價

發酵過程中，不同發酵基質最終發酵產物特征見圖5[20-22]。

圖5 不同發酵基質最終發酵產物特征Fig.5 The characteristics of final fermented products with different fermentation substrates

由圖5可知，以大米、小米為基質發酵菌絲最先生長，原料最先變紅，發酵至6天時，紅曲大米表面顏色鮮紅，斷面為粉紅色，色澤鮮艷，具有紅曲固有的曲香；紅曲小米表面呈橙紅色，斷面為米紅色；黑小米發酵至8天時顏色呈黑紅色；苦蕎麥仁呈深紅色，斷面為粉紅色；高粱、燕麥米[23]菌絲生長最慢，發酵至3天時，原料開始顯現紅色，最終發酵至8天時，顏色不再變化，原料本身顏色與紅色相間，具有些許紅曲固有的曲香，說明原料發酵不充分，這可能是由于原料表面種皮較厚，粉碎程度不高導致淀粉物質沒有被充分暴露出來，未能被充分利用，同時簡單的蒸煮方式導致淀粉熟化程度不夠，不利于紅曲菌種生長，造成原料利用不充分，因此以高粱、燕麥米為基質發酵菌絲生長緩慢，原料利用率低。

2.4 不同發酵基質對紅曲米洛伐他汀及桔青霉素含量的影響

不同發酵基質對紅曲米洛伐他汀及桔青霉素含量的影響見表1。

表1 不同發酵基質對紅曲米洛伐他汀及桔青霉素含量的影響Table 1 The effect of different fermentation substrates on the content of lovastatin and citrinin produced by monascus

不同發酵基質對紅曲產洛伐他汀及桔青霉素的含量有重要影響[24]，單獨以大米為發酵基質生產的功能性紅曲，其洛伐他汀含量最高，達到13.88 mg/g，小米、苦蕎麥仁、黑小米次之，燕麥米[25]、高粱較低；以苦蕎麥仁、小米為發酵基質生產的功能性紅曲桔青霉素的含量最低，為1.2 mg/kg，燕麥米桔青霉素的含量最高，為3.6 mg/kg。傳統功能紅曲通常以大米為原料，但是發酵過程中大米容易粘結，影響菌絲的生長，該實驗表明小米、苦蕎麥仁由于其顆粒度小，且在發酵過程中不易結團，分散性好，可以為微生物生長提供較好的生長面積，而且桔青霉素含量較低[26]，可以作為很好的發酵基質，高粱、燕麥米有較厚的種皮，紅曲菌生長困難，經粉碎處理后菌絲生長旺盛，洛伐他汀含量略有提高，但在發酵過程中需要不斷地補充水分，而且燕麥紅曲米的桔青霉素含量較高，這可能是由于原料中某種成分促進了桔青霉素的生成，因此確定將小米作為發酵基質可以滿足高洛伐他汀低桔青霉素的要求。

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