鮑溫病及佩吉特病患者皮損中GRIM 19表達水平的研究*

劉隨 劉斌 金汶 徐倩倩(湖北省藥學院附屬隨州醫院皮膚科, 湖北 隨州 441300)

鮑溫病是一種常見的原位皮膚鱗狀細胞癌, 常發生于老年人, 臨床上主要表現為皮膚表面出現邊緣不規則的褐色斑塊, 斑塊上方會有少量的鱗屑, 其發病原因有與長期暴露在紫外線、接觸某些化學試劑(如砷)、人類乳頭狀病毒的感染以及某些疾病(如著色干皮病、疣狀角化不良病)有關, 目前手術切除是治療鮑溫病的最有效治療方式[1-3]。佩吉特病分為乳腺佩吉特病和乳腺外佩吉特病, 該病具有易轉移浸潤, 易引發乳腺癌，乳腺外佩吉特病易引發泌尿生殖道或消化道癌、病程長等特點；手術切除是該病早期的主要治療方式[4-5]。盡管鮑溫病和佩吉特病在臨床上困擾患者多年, 但是它們的發病具體機制尚不清楚。干擾素與維甲酸聯合應用誘導細胞凋亡相關基因 19(GRIM 19)是一種與腫瘤細胞的生長有關的抑癌基因, 其能夠參與調控癌細胞的遷移、浸潤及生長, 近些年成為腫瘤領域的研究熱點[6-7]。此外, 研究發現GRIM 19在部分癌細胞中表達水平顯著下降[8]。GRIM 19與鮑溫病和佩吉特病之間是否有關系尚不得知, 本研究通過檢測鮑溫病和佩吉特病患者皮損部位GRIM 19水平, 探究GRIM 19與鮑溫病和佩吉特病之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2015年7月～2016年7我院診療的鮑溫病和佩吉特病患者共70例。其中鮑溫病患者37例, 其中男性14例, 女性23例, 平均年齡(57.1±8.9)歲, 患者患病區域分別在四肢(上肢患病13例, 男性4例, 女性9例；下肢患病12例, 男性4例, 女性8例)和軀干(12例, 男性6例, 女性6例)；佩吉特病患者33例, 其中男性8例, 女性25例, 平均年齡(59.1±9.7)歲, 其中乳腺佩吉特病17例(患病位置均是乳房區域, 患者均為女性), 乳腺外佩吉特病16例(患病區域在腋窩5例, 男性2例, 女性3例；患病區域在腹股溝6例, 其中男性3例, 女性3例；患病區域在外耳道5例, 其中男性3例, 女性2例)。健康正常人34例, 其中男性13例, 女性21例, 平均年齡(58.7±8.3)歲, 均自愿參與該研究。鮑溫病患者的年齡、性別和佩吉特病患者的年齡、性別分別與健康正常人的年齡、性別之間無顯著性差異。納入標準: ①符合鮑溫病和佩吉特病的診斷標準。②血常規、肝、腎功能正常。③自愿接受樣本采集。排除標準：①不符合本病診斷標準的患者。②接受過化療的患者。③癌細胞轉移或復發者。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 鮑溫病和佩吉特病患者皮損組織樣本由本科室臨床醫生采集, 采集后的皮損組織部分置于4%多聚甲醛固定, 用于免疫組化檢測, 剩余部分皮損組織置于液氮保存, 用于Real-time PCR檢測。根據患者的患病區域, 在本單位皮膚整形科室盡可能收集與每個患者患病區域對應的健康人皮膚組織(通過檢測收集到不同部位健康皮膚組織中的GRIM 19表達水平, 我們發現皮膚組織GRIM 19表達水平無顯著的區域差異性), 這些皮膚組織部分置于4%多聚甲醛固定, 用于免疫組化檢測, 剩余部分皮膚組織置于液氮保存, 用于Real-time PCR檢測。

1.2.2 Real-time PCR檢測 將健康皮膚及皮損組織研磨, 應用Trizol法提取皮膚組織的總RNA, 以總RNA為模板, Oligo(dT)18為引物反轉錄合成cDNA, 選用在皮膚組織中穩定表達的β-actin 作為內參, 應用Real-time PCR 測定健康皮膚及皮損組織GRIM 19 mRNA表達水平, GRIM 19上游引物: 5'-CACGGATCGTCCACAGCCC-3', 下游引物: 5'-TCAGGACAATCGTGGACAC-3'；β-actin上游引物: 5'-ACATCTGCTGAAGGTGGAC-3', 下游引物: 5'-GGTACCACCATACCAGG-3'。

1.2.3 免疫組化 取4%多聚甲醛固定的健康皮膚組織及皮損組織, 經脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、抗原修復步驟后, 與兔抗人GRIM 19抗體(購于CST公司)在37℃下孵育1 h, TBS洗滌3次后, 與羊抗兔抗體于37℃下孵育1 h, TBS洗滌3次后, 采用DAB顯色, 在顯微鏡下拍攝結果, 被染成黃色或棕黃色者為陽性。并采用圖像分析軟件ImagePro Plus分析各樣本陽性表達強度。

2 結果

2.1 鮑溫病及佩吉特病患者皮損組織GRIM 19 mRNA表達水平的變化 Real-time PCR結果表明, 鮑溫病與佩吉特病患者皮損組織中GRIM 19 mRNA表達水平相比于健康人皮膚組織, 顯著下降(P<0.05), 見圖1。

圖1鮑溫病及佩吉特病皮損組織GRIM19mRNA表達水平與健康人皮膚組織對比

Figure1GRIM19mRNAexpressionsofkinlesionofpatientswithBowen'sdiseaseandPaget'sdiseaseandhealthypeople

注: A: 鮑溫病VS健康人①P<0.05；B: 佩吉特病VS健康人, ②P<0.01

2.2 鮑溫病及佩吉特病患者皮損組織GRIM 19 蛋白表達水平的變化 免疫組化結果表明, 鮑溫病及佩吉特病患者皮損組織中GRIM 19 蛋白表達水平相比于健康人皮膚組織顯著下降, 結果見圖2、圖3、圖4。

圖2鮑溫病及佩吉特病皮損組織GRIM19蛋白表達水平與健康人皮膚組織對比

Figure2GRIM19proteinexpressionsofkinlesionofpatientswithBowen'sdiseaseandPaget'sdiseaseandhealthypeople

注: A: 鮑溫病VS健康人, ①P<0.05；B: 佩吉特病VS健康人, ②P<0.01

圖3鮑溫病患者皮損組織及健康人皮膚組織中GRIM19免疫組化結果
Figure3TheimmunohistochemicalresultsofGRIM19inkinlesionofpatientswithBowen'sdiseaseandhealthypeople

圖4 佩吉特病患者皮損組織及健康人相應皮膚組織中GRIM 19免疫組化結果Figure 4 The immunohistochemical results of GRIM 19 in kin lesion of patients with Paget's disease and healthy people

3 討論

GRIM 19最早是由美國馬里蘭州大學腫瘤中心研究人員于2000年發現, 主要存在于線粒體內膜上, 能夠參與構成線粒體復合體I[9]。隨著研究深入, GRIM 19近年被公認為一種抑癌基因[10]。GRIM 19誘導細胞凋亡的機制比較復雜, 但研究表明其發揮功能主要是通過調節線粒體內呼吸鏈。復合體I是線粒體內主要呼吸鏈的重要組成成分, 而GRIM 19是復合體I的功能單位, 其通過調節線粒體內的呼吸鏈活動, 進而影響細胞內的能量產生, 當細胞生長異常時, GRIM 19通過抑制細胞內呼吸鏈呼吸強度, 進而誘導細胞的凋亡[8, 11]。除了通過調節細胞呼吸鏈調節細胞生存狀態, 研究還發現GRIM 19可以通過調節STAT3, 進而促進癌細胞的凋亡[12-13]。體外實驗發現, 當癌細胞表達的GRIM 19水平升高后, GRIM 19結合的STAT3含量也相應增多, 而癌細胞的增殖轉移能力受到顯著的抑制[14]。

GRIM 19在人體組織器官中普遍表達, 且在心臟及骨骼肌中表達量較高[15]。但是研究發現, GRIM 19在肺癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、神經膠質瘤以及甲狀腺Hurthle細胞腫瘤組織中表達水平顯著下降, 且GRIM 19表達水平與肺癌的臨床分期呈負相關；GRIM 19在肝癌及乳腺癌細胞中的水平與肝癌細胞轉移、浸潤能力有關；GRIM 19在宮頸癌、食管癌、前列腺癌、卵巢癌等腫瘤細胞中的水平與腫瘤的惡性程度以及預后有關系[15-17]。因此, 通過研究腫瘤GRIM 19有利于腫瘤細胞的診斷分型、預后等, 且GRIM 19能夠作為治療這些腫瘤的新靶點。鮑溫病及佩吉特病是常見的皮膚腫瘤疾病, 手術時治療該類疾病的主要方式, 目前關于鮑溫病及佩吉特病發病機制及治療靶點的研究尚不足。本研究發現, 健康人皮膚組織表皮基底層細胞高表達GRIM 19, 而鮑溫病及佩吉特病患者皮損癌組織中GRIM 19表達水平顯著低于健康人皮膚組織水平。而GRIM 19作為一個細胞凋亡調控因子, 可特異性地與信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)結合, 阻斷細胞質內的STAT3進入細胞核, 通過下調STAT3的轉錄激活活性, 抑制其靶基因的表達, 繼而控制細胞的生長[18-19]。故鮑溫病及佩吉特病的發生、發展可能干擾了GRIM 19的正常表達, 致使該因子對細胞生長的調控作用失效, 最終導致細胞惡性增殖的發生。而GRIM 19是否是鮑溫病及佩吉特病發生、發展過程中的關鍵分子需要進一步實驗去確定。

4 結論

本文資料顯示，GRIM 19與鮑溫病及佩吉特病存在相關性, 提示GRIM 19可能在鮑溫病及佩吉特病發病過程中扮演重要角色, 為鮑溫病及佩吉特病臨床診斷分型及發病機制的研究提供了理論基礎。

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