HMGB1在重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷中的表達及烏司他丁的干預效應*

王靜 黃忠 魏尉 候聰 王霆宇 羅紅發(自貢市第一人民醫院消化內科，四川 自貢 643000)

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP) 死亡率高， 近年來有研究提示作為始發因子的腫瘤壞死因子(TNF-α)通過級聯反應形成瀑布效應導致全身炎癥反應綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)的發生[1]，而高遷移率族蛋白-1(HMGB1 )[2]作為晚期炎性介質，或許通過某些傳導通路加重SAP，烏司他丁(ulinastatin)則可減少SIRS及MODS的發生并改善預后。其中急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)/急性肺損傷(Acute Lunginjury,ALI)為其最嚴重且最常見的并發癥之一，能給予早期防治對降低其病死率意義重大。本研究試圖通過SAP大鼠模型及采用烏司他丁干預，探討HMGB1、TNF-α、白介素1β(IL-1β)在SAP大鼠胰腺炎肺損傷中的機理及烏司他丁的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 健康SD大鼠54只(雄性，清潔級，體質量200～250g)；?；悄懰徕c；烏司他丁；大鼠 HMGB1、TNF-α、IL-1β的ELISA試劑盒；大鼠HMGB1多克隆抗體。

1.2 動物分組及造模 SD大鼠54只，完全隨機分為SAP組、治療組及對照組三組，每組各18只，每組再各分為6、12和24h亞組(n=6)。①對照組：開腹后僅撥動胰腺組織。②SAP組：參照Zhang等[3]方法用制作SAP模型。③治療組：于SAP大鼠尾靜脈注射烏司他丁予以治療。

1.3 各指標的測定及方法 于6、12和24h分別處死各組大鼠，提取血清及胰腺、肺組織，血清用于ELISA檢測；胰腺及肺組織用于病理學檢測，其中胰腺組織行免疫組化檢測及ELISA檢測。

1.4 胰腺及肺病理觀察 胰腺按Schimidt法[4]評分 將肺按Frank法[5]評分 ，EPS-G7法檢測動脈血氣分析；ELISA法檢測血清、肺、胰中的HMGB1蛋白濃度；ELISA法檢測血清中的TNF-α、IL-1β蛋白濃度；免疫法檢測胰腺組織中的HMGB1，免疫組化結果判定[6]：結果判定在放大400倍的條件下。細胞膜或胞漿內棕黃色顆粒為(+)，選擇10個高倍視野，據HMGB1陽性細胞與總細胞數比值定為0～4分：陽性細胞數<5%記0分，陽性細胞數5%．25%記1分，陽性細胞數26%．50%記2分，陽性細胞數5l%．75%記3分，陽性細胞數>75%記4分。

2 結果

2.1 3組大鼠胰腺組織病理改變 ①胰腺組織：對照組大鼠胰腺鏡下無明顯變化；鏡下可見SAP組胰腺小葉間水腫、破壞、出血、炎性細胞浸潤、壞死。SAP組、治療組評分明顯高于對照組且具有統計學意義(P<0.05)，見圖1。② 肺組織：對照組大鼠胰腺及鏡下無明顯變化；SAP組大體可見，肺表面呈暗紅色，可伴胸腔少量積液；SAP組可見肺間隔增寬，肺組織水腫、出血、肺泡腔融合、大量炎性細胞積聚甚至肺實變，SAP組及治療組肺病理改變隨時間延長而加重，嚴重程度：24>12>6h，差異有統計學意義(P<0.05)，各組大鼠肺病理評分，見表1。③ 胰腺組織HMGB1表達見圖2。

圖1 3組大鼠胰腺組織病理HE染色(×400)Figure 1 Histopathological changes of pancreas in three groups observed by HE staining (× 400)

圖2 3組大鼠胰腺組織中的HMGB1表達(EnVision兩步免疫組織化學法×400)Figure 2 HMGB1 expression in pancreatic tissue of three groups (× 400)

2.2 血氧分壓測定 SAP組、治療組血氧分壓數值明顯低于對照組且差異有統計學意義(P<0.05)；治療組數值明顯高于SAP組且低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

Table1Comparisonofthepathologicalscoresofthepancreasandlungtissueandthechangeofbloodoxygenpartialpressure

組別術后時間(h)胰腺組織肺組織血氧分壓(mmHg)對照組61．21±0．222．33±0．1989．33±3．99121．33±0．212．47±0．2288．47±4．29241．39±0．252．66±0．2587．64±4．75SAP組68．11±0．70①3．88±0．30①78．64±7．31①1210．60±0．69①4．82±0．41①72．45±8．67①2412．12±0．73①5．75±0．39①67．34±7．6①治療組65．37±0．18①②2．91±0．33①②85．71±7．12①②127．77±0．36①②3．46±0．19①②80．42±6．73①②249．88±0．56①②4．65±0．23①②74．92±7．55①②

注：與對照組同期比較，①P<0.05；與SAP組同期比較，②P<0.05

2.3 ELISA法檢測血清、胰腺及肺中的HMGB1蛋白濃度 各濃度在6～24h持續上升，與對照組比較升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，治療組與 SAP組比較降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.4 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β蛋白濃度 SAP組、治療組的血清中的TNF-α、IL-1β蛋白濃度在6h 至2h繼續升高，于24h下降，與對照組比較升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，治療組與 SAP組比較降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3

Table2HMGB1proteinconcentrationinserum,pancreasandlungtissue

組別術后時間(h)血清中的HMGB1(ng/ml)胰腺中的HMGB1(ng/ml)肺中的HMGB1(ng/ml)對照組698±15．6150±13．7112±14．112103±16．2155±14．9123±17．524110±13．4177±15．5136±20．3SAP組6223±11．5①233±17．1①192±27．7①12287±20．9①337±18．7①273±23．3①24362±19．3①375±22．5①308±24．9①治療組6223±15．8①②205±20．8①②172±19．5①②12241±17．5①②280±16．3①②221±23．4①②24279±21．6①②304±23．5①②259±18．3①②

注：與對照組同期比較,①P<0.05； 與SAP組同期比較，②P<0.05

表3 各組大鼠血TNF-α、IL-1β水平比較Table 3 The blood TNF-α and IL-1β in each group

注：與對照組同期比較,①P<0.05； 與SAP組同期比較，②P<0.05

2.5 胰腺中HMGB1表達(免疫組化) 在對照組少量腺泡細胞胞漿表達，SAP組胰腺腺泡胸次漿及胞核可見HMGB1強表達：SAP組>治療組>對照組，從6～24h持續上升，見表4。

Table4ThepancreaticHMGB1positivecellsscorewithimmunocytochemistry

組別術后6h術后12h術后24h對照組0．111±0．0190．141±0．0210．152±0．019SAP組2．711±0．316①3．61±0．471①3．832±0．419①治療組2．132±0．345①②2．762±0．545①②3．007±0．423①②

注：與對照組同期比較,①P<0.05； 與SAP組同期比較，②P<0.05

3 討論

HMGB1為非組DNA結合蛋白，可通過多途徑促使炎癥反應增強，致炎癥失控遷延[7]。Mouri[8]等從基因水平揭露HMGB1與其他炎性介質相互加強的分泌效應及其相關的分泌調節網絡。細胞受損壞死時, 核內HMGB1釋放到細胞外激活免疫及炎性反應，致單核等細胞分泌炎性因子。而炎性因子刺激HMGB1分泌成為正反饋環路, 再加重炎癥反應[9]。

SAP病死率高，1周內病死者多為ARDS/ ALI所致。因此，在SAP早期降低肺損傷具有十分重要的意義。TNF-α和 IL-1β為SAP早期促炎因子，在肺損傷中TNF-α和IL-6主要作用是使聚集中性粒細胞并激活釋放氧自由基且損傷其內皮細胞[10]。c-Jun氨基端激酶(JNK)為SAP加重的關鍵介質之一，各類炎癥因子可激活JNK信號通路，而該通路激活又可反過來進一步加重炎癥反應[11]。研究發現[12]炎癥因子如TNF-a、IL-1等引起的JNK信號通路激活可通過上調激活蛋白-1(AP-1)的轉錄活性，促進肺損傷發生。有研究[13]證實JNK信號通路在SAP相關肺損傷中起關鍵作用，TNF-a可誘導單核因子如IL-1β、IL-6合成，觸發炎癥級聯反應[14]。

本實驗表明SAP胰腺損傷與HMGB的異常表達有關。同時，HMGB1表達上升比TNF-α和 IL-1β晚：胰腺中和血清及胰腺組織中的HMGB1數據顯示，從6～24 h持續上升，進一步證明HMGB1為晚期炎性介質。Yuan[15]等研究顯示，HMGB1可能以關鍵性的晚期炎癥因子參加了SAP的炎癥反應及各器官損害。也有學者證實HMGB1可進一步加重體液外滲，形成胰源性腹水[16]，楊智勇等[17]則發現SAP組大鼠血清TNF-α和 IL-1β水平在建模后迅速升高，在6～12 h持續上升，24小時開始下降，本研究也進一步證明TNF-α和 IL-1β為早期炎性介質。

烏司他丁對胰蛋白酶等多種酶有抑制作用，還能抑制溶酶體酶的釋放，清除氧自由基，阻斷中性細胞聚集，抑制炎癥因子及介質的釋放[18]，減輕SAP中SIRS反應并預防肺損傷的發生。楊野等[19]實驗顯示作為晚期炎性介質的HMGB-1可能參與了SAP肝損傷的過程；李梁等[20]運用meta分析顯示，烏司他丁治療SAP的療效勝于常規治療,其效果主要出現在病程中晚期。本實驗進一步證實烏司他丁能有效治療SAP。

4 結論與啟示

SAP大鼠胰腺中的致炎作用可能是由早期炎癥因子TNF-α、 IL-1β等激活JNK信號通路，且促炎因子促使HMGB1分泌形成正反饋環路,HMGB1可通過級聯反應形成瀑布效應，最終使炎癥失控遷延。而烏司他丁可能是通過降低SAP大鼠胰腺組織中的HMGB1、TNF-α、 IL-1β的表達及中斷JNK信號通路而發揮保護作用。因此，通過降低HMGB1及TNF-α、 IL-1β的表達及中斷JNK信號通路為治療靶點，可望用于治療SAP。

[1]吳灝，孫婧，蘇紅，等．連續性腎臟替代療法治療重癥急性胰腺炎合并急性腎損傷患者的臨床分析[J]．內科急危重癥雜志，2011，17，(2)：84-87.

[2]Wang H, Li W, Goldstein R,etal. HMGB1 as a potential therapeutic target [J]. Novartis Found Symp,2007,280(1):73-85.

[3]Zhang JX，Dang SC，Qu JG，etal．Preventive effect of tetramethylpyrazine on intestinal mucosal injury in rats with acute necrotizing pancreatitis [J]．World J Gastroenterol, 2006, 12(39)：6386-6390．

[4]Schmidt J，Rattner DW，Lewandrewshi K，etal．A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J]．Ann Surg，1992，215 (1)：44-56．

[5]Frank JA，Pittet JF，Wray C，etalProtection from exper-miental ventilator-induced acute lung injury by IL-1 receptor blockade[J]．Thorax，2008，63(2)：147-153．

[6]史學深，方馳華，朱明德，等．重癥急性胰腺炎大鼠DDFA對肺損傷細胞凋亡及Bax,Bcl-2表達的影響[J]．第四軍醫大學學報，2006，27，(2)：1093-1096.

[7]Yan Yu, Min Xie, Rui Kang,etal．HMGB1 is a therapeutic target for leukemia[J]．Am J Blood Res， 2012, 2(1): 36-43.

[8]Mouri F，Tsukada J，Mizobe T，etal．Intracellular HMGB1 transactivates the human IL1B gene promoter through association with an Ets transcription factor PU.1[J]．Eur J Haematol，2008，80：10-19．

[9]劉旺華,李花,肖獻忠. 高遷移率族蛋白B-1與炎癥關系的研究進展 [J]. 中國病理生理雜志， 2008，24 (8)：1656-1660．

[10] 王彬，張曉華．細胞因子在重癥急性胰腺炎合并急性肺損傷中的 作用[J]．醫學研究生學報，2012，25(11)：1208-1212.

[11] Minutoli L，Altavilla D，Marini H，etal．Protective effects of SP600125 a new inhibitor of c-jun N．terminal kinase (JNK)and extracellular-regulated kinase(ERKl/2)in an experimental model of cerulein·induced pancreatitis[J]． Life Sci，2004，75(24)：2853-2866.

[12] Kanagawa F，Takahashi T，Inoue K，etal．Protective effect of carbon monoxide inhalation on lung injury after hemorrhagic shock/resuscitation in rats[J]．J Trauma， 2010，69(1)：185-194．

[13] Liu M，Shi L，Chen M，etal．Effects of c-Jun N-terminal kinase signaling pathway on severe acute pancreatitis· associated lung injury[J]．Pancreas，2012，41(3)：358-366．

[14] 石亮亮，劉明東，朱浩，等．丹參酮ⅡA磺酸鈉對急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷的抗炎作用及其機制研究[J]．胃腸病學，2014，19，(06)：332-335.

[15] Yuan H，Jin X，Sun J，etal. Protective effect of HMGB1 a box no organ injury of acute pancreatitis in mice [J]. Pancreas，2009，38(2)：143-148.

[16] Wanten G，Kusters A，van Emst-de Vries SE，etal．Lipid effects on neutrophil calcium signaling induced by opsonized particles：platelet activating factor is only part of the story[J]．Clin Nutr，2004，23(4)：623-630.

[17] 楊智勇，王春友，熊烱圻. 重癥急性胰腺炎大鼠血清高遷移 率族蛋白-1水平的時相變化及意義[J]. 華中科技大學學報：醫學版，2004，33(4)：466-468.

[18] Park W Y， Goodman R B， Steinberg K P，etal． Cytokine balance in the lungs of patients with acute respiratory distress syndrome[J]． Am J Respiratory Crit Care Med，2001，164(1) : 1896.

[19] 楊野，欒正剛, 郭仁宣. 重癥急性胰腺炎大鼠肝組織HMGB1 表達與肝功能損害的關系[J]. 中國醫科大學學報， 2008，6(37)：343-345.

[20] 李梁, 鄭立君. 烏司他丁治療急性重癥胰腺炎的meta分析[J]. 同 濟大學 學報 ( 醫學 版 ), 2013，2(34)：62-68.