玉屏風散加味方對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥微環境的影響

衛 娜，王曉曉，王映棋，李 寧，程 羽，田守征，袁嘉麗

(云南中醫學院，云南 昆明 650500)

近年來，由于霧霾等大氣污染越來越嚴重，呼吸系統疾病的發病率逐年上升，預計到2020年慢性阻塞性肺疾病(COPD)將上升至全球致死病因第三位、疾病經濟負擔第五位[1]。氣道炎癥和氣道重塑是COPD的基本病理特征之一，氣道炎癥既是COPD發病的主要原因，同時也是造成氣流受限和氣道重塑的重要原因。COPD氣道炎癥反應過程中的炎癥細胞、炎癥遞質、氣道的定植菌、氣道局部黏膜免疫分子、受損的細胞器以及細胞代謝產物等構成了氣道炎癥微環境。當病原微生物等進入機體時，會刺激機體產生相應的防御反應，招募并活化多種炎癥細胞和炎癥遞質聚集在氣道局部[2]，氣道局部微環境平衡被打破，當機體這種防御反應不能消除病原微生物時，就會發展成慢性氣道炎癥[3]，進一步損傷氣道結構細胞，導致氣道壁損傷和修復反復進行，最終形成氣道重塑。可見，氣道局部微環境失衡對于COPD的發生發展有著重要影響。玉屏風散加味方是云南省名中醫李慶生教授的臨床驗方，該方緊扣COPD本虛標實的基本病機而選方用藥，對于氣道重塑相關因子MMP-9、TIMP-1、TGF-β1均有調節作用[4]。本研究進一步探討了玉屏風散加味方對氣道炎癥微環境中分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、多聚免疫球蛋白受體分泌片(SC)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-8(IL-8)的影響，旨在為該方治療COPD提供實驗依據。

1 實驗資料

1.1實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠36只，體質量180～220 g，由四川省達碩生物研究所提供，合格證號：0018491；許可證號：SCXK(川)2013-24。

1.2試劑及儀器 脂多糖(LPS，美國Simga公司生產，規格：10 mg/支)，紅塔山牌香煙[84 mm烤煙型香煙，紅塔煙草(集團)有限責任公司]，大鼠SIgA、SC、TNF-α、IL-8酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)。自制有機玻璃煙熏箱(50 cm×40 cm×30 cm)，電熱恒溫干燥箱(湖北省黃石市醫療器械廠)，YP型電子天平(上海光正醫療器械有限公司)，FA1204C型電子天平(常州科源電子儀器有限公司)，石蠟切片機(Leica RM2245，德國徠卡)，攤片機(Leica HI1210, 德國徠卡)，烘片機(Leica HI1220，德國徠卡)，臺式高速冷凍離心機(H1850R，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)，顯微鏡(Cl/Ds-Fi型，日本尼康)。

1.3藥物及制備 玉屏風散加味方：黃芪30 g、白術20 g、防風10 g、桑白皮15 g、浙貝母15 g、白芥子15 g、三七9 g、莪術15 g。根據生藥與浸膏的比值，按照成人臨床服藥濃度換算為大鼠給藥濃度，每只大鼠每日需給全方生藥量17.2 g/kg為高劑量，低、中、高劑量比按1∶2∶4計算[5]。羅紅霉素膠囊(江蘇聯環藥業股份有限公司生產，生產批號：20150802)成人臨床一日服藥量為300 mg，根據中藥給藥方法計算出每只大鼠每日所需給藥量為0.04 g/kg，給藥前用0.9%氯化鈉溶液制備成混懸液。

1.4實驗動物分組、造模及干預 將上述大鼠隨機分為正常組、模型組、羅紅霉素組、玉屏風散加味方低劑量組、玉屏風散加味方中劑量組、玉屏風散加味方高劑量組，每組6只。實驗開始前先適應性觀察1周。正常組于第1，14天在10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉下氣管內注入生理鹽水200 μL，其余時間正常飼養。其余組參照文獻[6]方法采用大鼠氣管內注入LPS和持續被動煙熏刺激的方法復制COPD大鼠模型，即分別于第1，14天在10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉下氣管內注入脂多糖200 μL,第2—13天和第15—56天上午將大鼠置入自制密閉有機玻璃箱內進行香煙煙熏，30 min/d。實驗造模周期共8周，模型成功后給予大鼠繼續隔天煙熏刺激8周，實驗第17周開始各給藥組給予相應劑量藥物灌胃，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，共灌胃28 d。

1.5檢測指標及方法 末次灌胃24 h后處死各組大鼠，取大鼠一側肺組織做病理切片，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肺組織病理學變化。取大鼠另一側肺組織400 mg用冰冷的生理鹽水沖洗去除血液，濾紙拭干，在研磨缽中倒入液氮預冷，將拭干后的肺組織放入研磨缽中，加入液氮，研磨。將研碎的肺組織倒入EP管中，加入1 mL磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.4)，用低溫離心機(3 000 r/min)離心20 min，取上清液，用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠肺組織勻漿中SIgA、SC、TNF-α、IL-8的表達水平。

2 結 果

2.1各組大鼠肺組織病理切片表現 正常組大鼠肺組織形態結構正常，支氣管上皮完整，纖毛結構完整、排列整齊，氣管、血管周圍無明顯炎癥反應，肺泡結構正常，腔內無明顯滲出物，見圖1。模型組大鼠氣管上皮脫落、充血，可見肺大泡，肺內細支氣管上皮增生、管腔變窄、管壁增厚，管壁及肺間質周圍可見炎性細胞浸潤，見圖2。羅紅霉素組大鼠肺內細支氣管周圍炎性細胞較模型組減少，肺泡間隔增寬，見圖3。玉屏風散加味方各組大鼠肺內細支氣管上皮增生不明顯，管壁及肺間質周圍炎性細胞浸潤不明顯，可見肺大泡，細支氣管管腔狹窄及間質炎性細胞浸潤等情況較模型組明顯改善，且高劑量組改善更明顯，見圖4～6。

圖1 正常組大鼠肺組織病理切片表現(10×10)

圖2 模型組大鼠肺組織病理切片表現(10×10)

圖3 羅紅霉素組大鼠肺組織病理切片表現(10×10)

2.2各組大鼠肺組織中SIgA、SC、TNF-α、IL-8表達水平 模型組大鼠肺組織中SIgA、IL-8 SC表達水平與正常組比較差異均無統計學意義(P均>>0.05)，TNF-α表達水平明顯高于正常組(P<0.05)。玉屏風散加味方低劑量組SIgA表達水平和玉屏風散加味方中、低劑量組SC表達水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，玉屏風散加味方高、低劑量組TNF-α表達水平明顯低于模型組(P均<0.05)；玉屏風散加味方高、中劑量組SIgA表達水平和玉屏風散加味方高劑量組SC表達水平、玉屏風散加味方中劑量組TNF-α表達水平、玉屏風散加味方各劑量組IL-8表達水平與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

圖4 玉屏風散加味方高劑量組大鼠肺組織病理切片表現(10×10)

圖5 玉屏風散加味方中劑量組大鼠肺組織病理切片表現(10×10)

圖6 玉屏風散加味方低劑量組大鼠肺組織病理切片表現(10×10)

3 討 論

表1 各組大鼠肺組織中SIgA、SC、TNF-α、IL-8表達水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

COPD屬于中醫“咳嗽”“肺脹”“喘證”等范疇[7]，基本病機是本虛標實，肺氣虛是該病的始發和根本原因[8]，痰濁、血瘀、水飲互結為標。COPD氣道炎癥反應實質上是氣道局部微環境失衡的一種表現。李慶生教授提出“中醫邪正發病學說與現代醫學的免疫及微生態平衡觀具有一致性”，并且認為正常的免疫功能及微生態平衡屬于“正氣”范疇，微生態失調與免疫功能低下或紊亂屬于“邪氣”范疇，因而在治療疾病時應注重調整失調狀態，補其不足、瀉其有余，恢復機體內部及與外環境的相對平衡協調[9-11]。玉屏風散加味方以“益氣扶正”經典方藥玉屏風散為基礎，配伍滌痰散結之桑白皮、浙貝母、白芥子，逐瘀散結之三七、莪術，通過“益氣扶正祛邪”調節氣道炎癥微環境，恢復局部微環境平衡，從而減輕氣道炎癥反應，延緩氣道重塑的發展。

呼吸道黏膜免疫系統作為黏膜免疫系統的重要組成部分，是保護呼吸道對抗外來有害物質侵襲的第一層防護墻。SIgA是呼吸道黏膜分泌的主要抗體，由J鏈連接2個單體IgA和分泌片SC組成，能保護黏膜防止細菌和病毒等黏附在黏膜表面，而被pIgR轉運至細胞內的IgA可以中和病毒的復制[12]。研究發現，當呼吸道黏膜中分泌的SIgA水平降低時，機體患上呼吸道感染的概率較大，SIgA水平與機體對抗上呼吸道感染的能力有直接關系[13]。IL-8是一種炎性遞質，能激活并趨化中性粒細胞，促使其脫顆粒和釋放彈性蛋白酶等物質損傷氣道[14]，目前在COPD急性期和穩定期患者的血清中均發現IL-8表達水平明顯高于正常對照組[15-16]，提示IL-8參與COPD發生發展。TNF-α是一種主要由單核細胞和巨噬細胞產生的促炎因子，除了能激活白細胞啟動炎癥反應外，還能通過誘導氣道黏液細胞的化生和高分泌、氣道上皮細胞TNF-α和IL-8等受體的表達，從而參與上皮細胞的損傷和肺氣腫；并且TNF-α還可以誘導中性粒細胞等生成IL-8，進一步加劇氣道炎癥[17]。

本實驗結果顯示，玉屏風散加味方各組大鼠肺組織病理情況較模型組有明顯改善，且高劑量組改善效果更明顯；模型組大鼠SIgA表達水平有低于正常組的趨勢(無統計學差異可能是由于樣本量較小所致)，這與張繼華等[18]的研究結果相符；模型組大鼠IL-8表達水平有低于正常組的趨勢，筆者推測或許是在復制大鼠模型時刺激了IL-8上游或是下游的某些機制而造成的，具體原因有待探索；模型組SC表達水平有高于正常組的趨勢，筆者推測其原因可能是受TNF-ɑ表達水平升高所影響。有研究顯示，TNF-α可通過誘導轉錄因子IRF-1的合成而影響pIgR的表達，當TNF-ɑ濃度增高時，pIgR mRNA的表達水平隨之升高[19]，具體原因有待后期進一步實驗探索。玉屏風散加味方低劑量組SIgA表達水平和玉屏風散加味方中、低劑量組SC表達水平均明顯高于模型組，玉屏風散加味方高、低劑量組TNF-α表達水平明顯低于模型組，玉屏風散加味方高、中劑量組SIgA表達水平和玉屏風散加味方高劑量組SC表達水平、玉屏風散加味方中劑量組TNF-α表達水平、玉屏風散加味方各劑量組IL-8表達水平與模型組比較差異均無統計學意義。提示玉屏風散加味方可以增強或恢復機體正常免疫防御功能，從而減輕氣道炎癥。

綜上所述，玉屏風散加味方可改善COPD模型大鼠肺組織病理形態，增強SIgA和SC的表達，降低TNF-α和IL-8的表達，提示該方藥可干預COPD氣道炎癥微環境，增強機體局部黏膜免疫功能，減輕炎癥反應。

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