溫經湯調節HER-2陽性乳腺癌術后患者陰陽平衡及對PD-1/PD-L1的影響

鄭 琎 傅春燕 陳述政

乳腺癌是女性常見的發病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，全球每年乳腺癌發病人數有135萬左右，死亡人數約33萬[1]，尤其是2012年，其發病人數高達170萬，且死亡人數高達52萬[2]。在臨床醫學手術治療、化療、放療、內分泌治療、分子靶向治療等手段下，仍為當前危害女性健康的頭號殺手。按照2007年發表于柳葉刀腫瘤學雜志分型法[3]，將乳腺癌分 為 LuminalA、LuminalB、HER-2positive 和Basal-like 4種亞型。曲妥珠單抗為第一個靶向治療HER-2（人類表皮生長因子受體-2）的人源性單克隆抗體，具有調控細胞生長因子信號傳導途徑等作用成為乳腺癌靶向治療的基石，在HER-2陽性乳腺癌患者輔助治療中有著重要地位[4]。腫瘤免疫逃逸機制使得免疫治療已成為當前研究重點，筆者應用溫經湯研究中醫“陰陽平衡”對HER-2陽性的乳腺癌患者機體免疫紊亂的調節作用，現報道如下。

1 臨床資料

選取本院2011年1月—2013年12月HER-2陽性乳腺癌手術后患者共65例，均為女性，分為治療組 33例，年齡 28～74歲，平均（43.5±16.5）歲，平均病程（6.4±3.7）年；對照組 32例，年齡 27～76歲，平均（42.3±17.3）歲，平均病程（5.9±3.1）年。兩組患者年齡及病程等一般資料方面差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。患者均知情同意且簽署知情同意書，經過醫院倫理委員會批準后實施。兩組患者診斷標準參考2011年版《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范》[5]。中醫診斷標準參考《中醫病證診斷療效標準》[6]，符合下焦虛寒、陰陽失調證型。均為HER-2陽性 [標準免疫組化（IHC）+++，或原位熒光雜交法（FISH）陽性；免疫組化檢測顯示 HER-2（+++），可以直接判斷為HER-2陽性；FISH檢測，比值＞2.2則可判斷為HER-2陽性]，及左心室射血分數（LVEF）＞60%者。

2 方法

治療組予曲妥珠單抗聯合中藥“溫經湯”治療，對照組給予曲妥珠單抗治療。曲妥珠單抗周療劑量為2mg/kg（首次劑量為4mg/kg），或3周1次劑量為6mg/kg（首次劑量為8mg/kg），共1年。“溫經湯”組方：吳茱萸 9g（先煎 30min），桂枝 5g，川芎 6g，當歸12g，白芍 9g，丹皮 12g，干姜 3g，麥冬 20g，清半夏10g（水洗），黨參 15g，生甘草 6g，東阿膠（烊化）、重樓各9g。1天1劑，加入700mL飲用水，浸泡30min，自動煎藥機煎煮，文火煎煮40min，液體包裝機灌裝每袋150mL，1天2袋，空腹或餐后1～2h口服。患者每周取藥1次。兩組其他綜合治療均一致，總治療周期均為48周。

觀察指標：檢測兩組患者治療前、治療后第24周、48周的血常規、腫瘤指標，外周血程序性死亡因子（PD-1）、程序性死亡因子配體-1（PD-L1），外周血IL-17，心臟彩超，常規B超；記錄每位患者治療前和治療后第24周、48周的中醫證候，以“八綱”為目，由副主任及以上中醫師辨別表里、寒熱、虛實；若左心室射血分數（LVEF）較治療前絕對數值下降≥16%或者LVEF＜正常范圍并且較治療前絕對數值下降≥10%，應停止曲妥珠單抗治療；若4～8周內LVEF回升至正常范圍或LVEF較治療前絕對數值下降≤15%，可恢復使用曲妥珠單抗。LVEF持續下降（＞8周），或者3次以上因心肌病而停止曲妥珠單抗治療，應永久停止使用曲妥珠單抗。常規B超提示有遠處轉移證據，則按2011年指南相應措施規范化治療。

血常規檢測采用全自動生化分析儀及配套試劑（編號E1003）；IL-17檢測：取清晨空腹外周靜脈血5ml，EDTA 抗凝，離心機 4000r/min，離心 5min，分離血漿后，置于零下20℃冰箱凍存，采用酶聯免疫吸附法（ELISA），嚴格按照試劑盒說明書操作。PD-1/PD-L1表達水平檢測：取3支專用流式管，分別加入抗人CD4-FITC抗體10μL和MouseIgG1-PE同型質控2.5μL、抗人CD4-FITC抗體10μL和抗PD-1-PE抗體2.5μL、抗人CD-FITC抗體10μL和抗人B7-H1-PE抗體2.5μL，然后每管各加入全血50μL，混勻，避光15min后加入1mL溶血劑，室溫放置10min，1500r離心，5min棄上清，再分別加入1mL生理鹽水，混勻，1500r離心，5min棄上清，最后加入500mL生理鹽水重懸細胞，上流式細胞儀（美國BECKMANCOULTE公司）檢測。采用FS-SS參數分析基礎上，對全PBMC設門，設定CD4陽性細胞門，檢測CD4+T細胞上PD-L1/PD-1的表達水平，并扣除同型對照的非特異性本底值。

統計學方法：應用SPSS19.0統計軟件進行數據統計學分析，計量資料以（x±s）表示，組間計量資料比較采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

治療過程中治療組有3例LVEF第4周持續下降，對照組1例持續下降，1例鎖骨上淋巴結腫大而更改方案治療，最終兩組各30例入組數據分析。

3.1 兩組外周血PD-1表達水平比較 治療前兩組PD-1差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后兩組PD-1均不同程度下降，治療48周后，治療組PD-1低于對照組，與治療前和對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表 1。

3.2 兩組外周血PD-L1表達水平比較 治療前兩組PD-L1差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后兩組PD-L1均不同程度下降，治療48周后，治療組PDL1低于對照組，與治療前和對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表 2。

3.3 兩組WBC、RBC、PLT比較 治療前兩組患者白細胞計數（WBC）、紅細胞計數（RBC）、血小板計數（PLT）相比，差異均無統計學意義（P＞0.05）。治療后，治療組患者WBC計數與治療前相比有所升高，對照組反而稍有下降，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組RBC和PLT比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表 3。

表2 兩組HER-2陽性乳腺癌患者血 PD-L1表達水平比較[例（%）]

表3 兩組HER-2陽性乳腺癌患者WBC、RBC、PLT比較（×109/L，x±s）

3.4 兩組外周血IL-17表達水平比較 治療前兩組IL-17差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后兩組IL-17均不同程度下降，但對照組治療前后比較差異無統計學意義（P＞0.05），治療組治療48周與治療前及對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 兩組HER-2陽性乳腺癌患者血IL-17表達水平比較（pg/mL，x±s）

3.5 兩組“八綱”條目比較 治療組治療前后“里虛寒”患者構成比由36%下降到13.7%，對照組“里虛寒”構成比由37%下降到26%，治療組療效更顯著，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 5。

3.6 兩組安全性指標比較 治療過程中，兩組均未見明顯不良反應，與對照組治療后比較，兩組在心超、心電圖、B超、尿常規等方面差異均無統計學意義（P＞0.05），見表 6。

4 討論

根據乳腺癌發病的四診內容，參考歷代醫家文獻，乳腺癌可以歸于“乳巖”、“乳石癰”、“石榴”、“乳栗”等病證，歷代醫家對乳巖的病因、病機、癥候及證治具有獨到的見解。《難經》曰：“積者，陰氣也，其始發有常處，其痛不離其部，上下有所終始，左右有所窮處。”《黃帝內經》曰：“任脈為病，女子帶下癓瘕。”[7]任脈在女子諸病尤其是積病上至關重要。《金匱要略·婦人雜病脈證并治》言：“婦人年五十，暮即發熱，少腹急，腹滿，手掌煩熱，唇口干燥，何也？師曰：此病屬帶下，瘀血在少腹不去，當以溫經湯主之。”[8]溫經湯亦主婦人少腹寒，久不受胎；兼取崩中去血，或月水來過多，及至期不來。該方是一張調任脈的祖方，堪稱女科第一方，此“帶下”之病機乃屬地道不通，厥陰虛寒，水不生木，任脈失交與陽明土和厥陰木，故主任脈也。“溫經湯”方意可理解為合“吳茱萸湯”、“桂枝湯”、“膠姜湯”、“麥門冬湯”、“桂枝茯苓丸”而成一方。“桂枝湯”為群方之冠，外調營衛氣血，內調七情之雜病，桂枝湯為升厥陰肝木的第一要法。肝藏血，血得溫乃升，桂枝性溫，白芍濡養肝木，當歸助肝藏血。地道不通，水生木，腎水竭，補天道生水，故真水只能由脾胃生化而來，因此用了吳茱萸湯和麥門冬湯，這便是“一氣周流”。厥陰肝木不能升達，少陽相火不降，則陽明不能降，是故手掌心熱，所以用半夏，麥冬來降陽明土。相火下耗腎水，上則口干口苦，發枯經閉，精血橫溢，月經淋漓不盡，不得有子，少腹急，厥陰肝木不能達，小腹滿，脾氣不能升達。女子以血為主，任脈、厥陰肝都是以血濡養的經脈，陽明經亦是多血多氣之經，而任脈下系肝腎上系陽明，三經皆布散于口唇，因此嘴唇干癟干燥，是女子血虧的第一表現。正如《內經》言：“二八女子，唇紅齒白。”氣血充盈是也。溫經湯，溫的是任脈的經血，故溫經湯有培補先天以滋后天，凱旋升降，交通左右之功。《內經》認為陰陽乃浮沉生死之門，左右為其道路，水火為其征兆，故調陰陽之法門在于其“左右、浮沉、水火”六字，這也是溫經湯調和女子陰陽第一主方之原由，正所謂，陰平陽秘，精神乃治。

表5 兩組HER-2陽性乳腺癌患者“八綱”條目比較[例（%）]

表6 兩組HER-2陽性乳腺癌患者一般安全性指標比較（例）

現代醫學認為，HER-2受體是人類表皮生長因子受體EGFR家族的第2個成員，由位于17號染色體q21上，編碼分子質量185k的跨膜蛋白表達，有抑制腫瘤細胞凋亡和促進腫瘤細胞生長等作用，因此對于HER-2陽性的乳腺癌患者，機體免疫功能紊亂更為復雜。HER-2陽性的乳腺癌患者通過體內HER1/HER3/HER4與相應配體結合后，與HER-2形成異二聚體，磷酸化膜內酪氨酸激酶，生長因子受體結合蛋白及其相關銜接蛋白通過SH2結構域連接到HER2的C端激活蛋白SOS，促進Ras釋放GDP進而使MEK磷酸化，最終激活MAPK[9]，參與腫瘤的生長、分化、炎癥、凋亡等機制。曲妥珠單抗是靶向HER-2 的抗體，臨床研究[10]顯示，譬如 NCCTG、N9831、HERA、BCIRG006、I-SPY2等均可以明顯提高HER-2陽性的乳腺癌患者無病生存期（DFS）和總生存（OS）。HER-2陽性的乳腺癌患者與機體細胞免疫功能低下密切相關，乳腺癌微環境中免疫細胞及細胞因子可有效促進和抑制腫瘤的生長，以T淋巴細胞為主，取決于抗原呈遞細胞（antigen-presenting cell，APC）和T細胞之間3類分子信號的綜合作用。其中輔助性細胞T（Th）是參與機體免疫應答的一類重要的免疫調節細胞，而輔助性T細胞17（Thl7）和調節性T細胞（Treg）在炎癥及免疫應答過程中發揮了重要的作用[11]。Th17細胞通過其特異性產生的效應因子IL-17發揮致炎作用；IL-17頻率增加，抑制活性升高，減弱特異性T淋巴細胞反應，導致腫瘤細胞生長[12-13]。

程序性死亡因子-1是近年來發現的一類能夠顯著抑制T細胞活化和調節T細胞免疫應答的CD28/B7家族成員。PD-1分子主要在活化的T細胞上表達，PD-1受體可通過與APC表面的配體PD-L1結合而發揮抑制T細胞反應的作用。PD-1可通過與配體PD-L1結合可通過阻斷CD28，激活介導的PI3K途徑而抑制T細胞的增殖和分化[14]。在有效激活T細胞的信號途徑中，負向的協同共刺激分子PD-1及其配體PD-L1的信號途徑是最新認為與腫瘤疫苗、雙特異性抗體、檢查點抑制劑及共刺激分子激動劑等腫瘤免疫治療方面很有治療前景的靶點[15-16]。本研究通過中醫調節整體“陰陽”平衡觀察HER-2陽性的乳腺癌術后患者免疫紊亂情況。治療48周后，治療組“里虛寒”構成比較治療前下降，且與對照組相比有明顯差異，顯示“溫經湯”可以通過“溫里、暖肝、運氣、活血”來調節人整體的陰陽狀態，使偏頗的“表里寒熱虛實”趨向平和，達到增強正氣、運行氣血、通調任脈的作用，即“正氣存內，邪不可干”之意。治療48周后，治療組外周血PD-1、PD-L1頻數均低于對照組同期水平，與基線相比也明顯下降。相關研究[17]發現，三陰型乳腺癌中PD-1在HER-2陽性腫瘤表達較高，也有報道[18]稱PD-1表達與HER-2的表達呈正相關，與ER表達呈負相關，與PR表達無關，在不同的乳腺癌亞型中無明顯差異；而治療組IL-17頻數較對照組明顯升高，白細胞也較對照組數目增多，機體整體的免疫功能增強。結果顯示“溫經湯”治療對患者已紊亂的免疫內環境有趨向再建平衡作用，可能是通過調節IL-17和PD-1/PD-L1的分泌改善機體免疫功能，或可為乳腺癌綜合防治及免疫治療瓶頸提供較有前景的靶點和方向。

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