顆粒體病毒(CnmeGV)對稻縱卷葉螟的感染及害蟲種群增長的影響

徐 健， 李傳明， 韓光杰， 徐 彬， 祁建杭， 孫 俊， 劉 琴

(1.江蘇里下河地區農業科學研究所，江蘇 揚州 225007； 2.揚州綠源生物化工有限公司，江蘇 揚州 225008)

桿狀病毒(Baculovirus)是特異性感染節肢動物的環狀雙鏈DNA病毒，主要分為核型多角體病毒(Nucleopolyhedtovirus，NPV)和顆粒體病毒(Granulovirus，GV)。宿主以昆蟲綱中的鱗翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目和毛翅目昆蟲為主，其中寄生鱗翅目昆蟲的桿狀病毒多達400余種[1]。由于桿狀病毒對人類和環境安全、寄主專一以及在害蟲種群中的擴散傳播形成對害蟲種群的自然調控作用，桿狀病毒作為重要的生防因子在害蟲綜合治理中受到廣泛關注[2]。蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)顆粒體病毒(CpGV)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)核型多角體病毒(SeNPV)、黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)核型多角體病毒(AgNPV)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera核型多角體病毒(HaNPV)等多種桿狀病毒被深入研究并推廣應用[3-4]。

稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis(Guenée))是東南亞和中國水稻上的重要害蟲[5-8]。多種化學農藥品種多次大量的使用不僅并未從根本上控制稻縱卷葉螟的爆發危害，還造成了水稻農藥殘留和嚴重的面源污染。龐義等[9]首次報道廣州恩平縣稻縱卷葉螟幼蟲感染流行性病毒病，病原為稻縱卷葉螟顆粒體病毒(C.medinalisgranulovirus，CnmeGV)。張珊等[10]在時隔30多年CnmeGV的首次采集地恩平縣，再次發現感染CnmeGV死亡的稻縱卷葉螟幼蟲，表明該病毒具有田間控制目標害蟲的持效性能。江蘇里下河地區農科所在野外稻田自然罹病死亡的稻縱卷葉螟幼蟲體內分離獲得稻縱卷葉螟病毒，掃描電鏡、病理學和分子生物學鑒定為顆粒體病毒[11]，同時首次完成了全基因組測序分析[12]。CnmeGV對稻縱卷葉螟具有較強的侵染力，105OB/mg濃度處理害蟲感染率達92%，作為潛在的生物控制因子具有重要的應用價值[13]。CnmeGV是侵染稻縱卷葉螟的專性桿狀病毒，相關研究特別是稻田自然條件下病毒對害蟲的致病性及種群動態的影響報道較少。本研究擬通過田間應用CnmeGV結合組建自然種群生命表進一步明確CnmeGV對稻縱卷葉螟的侵染及種群的干擾調控作用，為應用桿狀病毒生物防治稻縱卷葉螟提供依據。

1 材料與方法

1.1 CnmeGV的增殖

以江蘇里下河地區農業科學研究所實驗室保存的CnmeGV原始病毒液接種感染稻縱卷葉螟幼蟲。幼蟲繁殖參考Xu 等[14]方法采用人工飼料飼養。選擇2齡中期稻縱卷葉螟幼蟲預饑6 h后，接種于均勻混合1×105OB/g濃度CnmeGV的人工飼料上，在 (25.0±0.5) ℃、相對濕度80%、光照度2 000 lx的恒溫昆蟲飼養室飼養2 d后，隔日更換新鮮人工飼料并觀察蟲體感病情況。飼養8～15 d，收集感病死亡的蟲尸，研磨、勻漿、過濾，濾液經差速離心，得純化的顆粒體病毒。用血球計數板計數顆粒體病毒含量，以無菌水稀釋至1×1010OB/ml后置4 ℃保存備用。

1.2 田間試驗

試驗地位于揚州市甘泉鎮，常年稻麥輪作，規律性發生稻縱卷葉螟危害。第1代害蟲于當年6月底遷入，繁殖代及7月下旬遷入的稻縱卷葉螟構成第2代成為主要危害代。試驗地約0.2 hm2，種植水稻品種為揚稻6號(江蘇里下河地區農業科學研究所選育)。試驗設CnmeGV不同濃度和空白對照3個處理，每處理重復3次，共9個小區，每小區150 m2(10 m×15 m)，移栽水稻秧苗4 500穴。小區間間隔1 m，栽插4行水稻作為保護行，小區統一肥水管理。7月下旬稻縱卷葉螟第2代幼蟲孵化高峰期施藥，CnmeGV設 7.500×105OB/m2和1.125×106OB/m22個濃度，按75 ml/m2用水量稀釋噴霧，對照組以等量清水噴霧。

1.3 田間取樣和調查

施藥后隔日田間調查不同處理區稻縱卷葉螟幼蟲的存活率、病毒感染率。每小區隨機5點取樣，每點10穴，逐穴調查幼蟲的殘留存數，并根據稻縱卷葉螟幼蟲感染CnmeGV蟲體濁白、體節臃腫的感病癥狀區分記錄感染蟲數。設定對照組幼蟲自然死亡率為0，處理組蟲口減退率則計算為其相對死亡率。處理區幼蟲感染數除以總活蟲數則計算為CnmeGV感染率。幼蟲發育歷期3～4齡期，不同處理區采集50頭幼蟲于實驗室飼養，觀察計算絨繭蜂、寄生蠅等天敵寄生率。施藥后20 d，各小區分別記錄殘存幼蟲蟲齡，參考實驗種群各齡歷期[14]，各處理組調查總蟲齡歷期以對照組總蟲齡歷期校正計算獲得預期發育歷期。另采集高齡幼蟲50頭，室內飼養直至羽化，觀察記錄化蛹羽化情況，計算化蛹率、羽化率。

施藥前3 d田間成蟲盛發期，用捕蟲網采集50對成蟲，市售體積為125 ml的一次性塑料杯中置1對成蟲，加入浸有10%蜂蜜水的脫脂棉供其補充營養，用保鮮膜封口，每日更換脫脂棉，讓成蟲交配產卵。成蟲交配后產卵于杯壁上，逐日記錄成蟲的存活數和杯壁上的卵粒數，直至全部成蟲死亡，計算成蟲壽命及產卵量及孵化率。施藥后25 d，在不同處理區用捕蟲網采集成蟲，形態區分并計算性比，另取50對成蟲，按上述方法產卵并計算產卵量及孵化率。

1.4 數據分析

1.4.1 幼蟲存活曲線分析 以病毒處理區幼蟲蟲口相對減退率為處理區幼蟲死亡率，根據威布爾頻數分布理論模型(Weibull frequency distribution)[15]，參考周郁斌等[16]方法，采用Origin pro 8.0擬合稻縱卷葉螟幼蟲感染CnmeGV生長發育過程特定階段存活率曲線方程：S(t)=a-(a-b)exp[-(tk)d]。擬合后采用Log-Rank test分析種群存活率曲線間的差異性[17]。同時通過曲線方程計算幼蟲感染病毒后死亡起始、50%死亡預期時間，明確CnmeGV對稻縱卷葉螟幼蟲的致死作用。

1.4.2 自然種群生命表參數分析 參照昆蟲種群生命表的制作方法[18]，根據田間調查的數據及同期飼養所獲的數據，估算稻縱卷葉螟種群不同時期幼蟲、各蟲態的存活率，組建得到自然種群生命表，按如下方法計算生命表參數：

種群凈增殖率R0=∑lxmx

內稟增長率rm=(lnR0)/T

周限增長率λ=erm

世代平均周期T=∑lxmxx/∑lxmx

種群加倍時間DT=ln2/rm=0.693 1/rm

公式中lx表示x期間的存活率，mx表示x期間平均每雌產雌數。稻縱卷葉螟的幼蟲歷期、成蟲壽命、產卵量等均用DPS v7.05數據處理系統進行t-測驗。

種群趨勢指數I=N2/N1=S1S2S3,…,SkPFP♀，式中N1、N2為當代和下代的種群數量，S1S2S3,…,Sk為各作用因子相對應的存活率，P♀為雌蟲比率，PF為實際產出率。

種群控制指數IPC=I′/I，式中I為原有自然種群數量發展趨勢指數，I′為CnmeGV干擾作用下種群數量發展趨勢指數，用以比較CnmeGV干擾條件下對種群數量發展趨勢的控制作用。

2 結果與分析

2.1 CnmeGV在稻縱卷葉螟種群中的感染

稻縱卷葉螟接觸感染CnmeGV后，初始并不表現明顯的病毒感染癥狀，隨時間的推移，感病癥狀逐步呈現，表現出明顯的桿狀病毒感病癥狀，感病幼蟲體節腫脹，行動遲緩，體色由正常的綠色半透明狀逐漸變成灰白色而不透明，后期呈乳白色或略帶黃色，罹死病蟲從氣孔釋放出乳白色病毒液。田間應用CnmeGV后6 d田間始見感染病毒顯癥幼蟲，8 d感病蟲量顯著增加，顯癥感染率達17.6%～19.53%，18 d田間蟲齡處于3～4齡，表現感病癥狀的蟲量達51.63%～54.23%,24 d調查田間蟲態主要以5齡和老熟幼蟲為主，感病顯癥幼蟲比例達69.16%～70.77%。CnmeGV不同濃度處理稻縱卷葉螟幼蟲感染程度及變化規律基本一致(圖1)。

圖1 不同濃度CnmeGV處理后田間稻縱卷葉螟幼蟲的病毒感染動態Fig.1 The dynamic of rice leaffolder larvae infected by virus after spraying different concentration of CnmeGV

2.2 CnmeGV感染幼蟲存活曲線

圖2 CnmeGV感染稻縱卷葉螟幼蟲擬合威布爾分布方程存活曲線Fig.2 Survival curve of CnmeGV infecting population fitting with the model of Weibull frequency distribution

2.3 CnmeGV對稻縱卷葉螟種群的控制作用

根據田間調查結果結合室內飼養觀察結果，組建了稻縱卷葉螟田間的自然種群生命表，得到CnmeGV為作用因子的稻縱卷葉螟自然種群生命表參數。由表1可以看出，CnmeGV對稻縱卷葉螟種群具有明顯的調控作用，感染CnmeGV的稻縱卷葉螟種群平均世代周期(T)延長了 2.45～2.79 d，內稟增長率(rm)下降了40.21%～42.27%，致使子代稻縱卷葉螟種群增長趨勢指數(I)從20.03下降至6.30左右，同時種群加倍時間(DT)增加了 4.79～5.14 d。采用種群干擾作用控制指數分析表明，CnmeGV對稻縱卷葉螟種群控制作用明顯。CnmeGV不同濃度病毒處理區的種群控制指數(IPC)為 0.31～0.32，說明稻縱卷葉螟種群在CnmeGV干擾下子代種群增長趨勢下降為對照的0.3倍。

3 討 論

CnmeGV是感染稻縱卷葉螟幼蟲的專性桿狀病毒，田間害蟲卵孵化高峰期噴施病毒，CnmeGV通過稻縱卷葉螟幼蟲取食感染并逐步顯癥，后期田間種群感病率達70%左右，表明CnmeGV在一定濃度條件下對稻縱卷葉螟具有較強的致病性，這種侵染致病能力有助于病毒在稻縱卷葉螟種群中傳播擴散[19]。

表1田間CnmeGV不同濃度處理稻縱卷葉螟自然種群生命表參數

Table1ThelifetableparemetersofnaturalpopulationofriceleaffoldertreatedwithCnmeGV

生命表參數 對照CnmeGV7.500×105OB/m2CnmeGV1.125×106OB/m2平均世代周期(T)33.2136.0035.66內稟增長率(rm)0.0970.0560.058周限增長率(λ)1.101.061.06種群加倍時間(DT)7.1712.3111.96種群趨勢指數(I)20.036.356.32控制指數(IPC)1.000.310.32

昆蟲感染桿狀病毒到死亡需要經過一個緩慢的周期，桿狀病毒DNA進入細胞核經過復制、組裝、轉移侵染而增殖感染引起宿主死亡[20]。稻縱卷葉螟幼蟲感染CnmeGV一般在感病顯癥8.39～8.40 d開始死亡，感病幼蟲前期和中期仍能卷葉取食造成危害，感病幼蟲存活率曲線預期致死中時間需20 d以上。劉琴等[13]通過CnmeGV結合蘇云金桿菌防治稻縱卷葉螟，不僅顯著提高了田間稻縱卷葉螟的死亡率，而且病毒感染顯癥時間縮短了3 d，感染死亡率增加了20.23%。這種增效作用可能源于稻縱卷葉螟取食Bt毒素蛋白后直接造成害蟲中毒死亡，未死亡的個體蟲體免疫能力下降，提高了病毒的致病性[21]，因此可以考慮田間應用CnmeGV防治稻縱卷葉螟時結合蘇云金桿菌等生物農藥，以提高對稻縱卷葉螟的直接防治效果，同時提高害蟲的病毒感染率。

單一以蟲口減退率或卷葉率等直接防治指標并不能全面反映桿狀病毒對靶標害蟲的控制作用[22]。通過構建稻縱卷葉螟感染CnmeGV田間種群生命表，應用種群控制指數評價害蟲控制效果，進一步反映了桿狀病毒對稻縱卷葉螟種群發展趨勢的實際干擾控制作用。試驗結果表明，以種群趨勢指數和種群控制指數進行評價，CnmeGV對稻縱卷葉螟種群動態具有明顯的影響，應用CnmeGV后子代種群趨勢指數下降了3倍，可以有效控制稻縱卷葉螟的種群增長和爆發危害。

桿狀病毒在野外昆蟲種群中能引起流行病，導致繼代持續帶毒、感病死亡，長時間內自然控制種群消長[23]。目前桿狀病毒在昆蟲種群中的流行性研究主要集中在森林、果園等連續、穩定生態系統的害蟲防治中[24]。農作物由于周期性的收獲，直接干擾了桿狀病毒的侵染和傳播，相關報道較少。水稻(單季稻)一般生育期長達150 d，水稻生長周期中稻縱卷葉螟持續危害，一般發生3～5代，害蟲種群生態相對穩定，有利于CnmeGV在稻縱卷葉螟種群中擴散，在子代種群中持續傳播，從而控制種群增長，降低危害程度，減少稻田農藥使用量。

[1] ROHRMANN G F. Baculovirus molecular biology (3rd edition) [M]. Corvallis: Department of Microbiology Oregon State University, 2014.

[2] POPHAM H J, NUSAWARDANI T, BONNING B C. Introduction to the use of baculoviruses as biological insecticides [J]. Methods in Molecular Biology, 2007,1350(388): 359-366.

[3] SZEWCZYK B, HOYOS-CARVAJAL L, PALUSZEK M, et al. Baculoviruses—re-emerging biopesticides [J]. Biotechnology Advances, 2006, 24(2): 143-160.

[4] 秦啟聯,程清泉,張繼紅,等.昆蟲病毒生物殺蟲劑產業化及其展望[J]. 中國生物防治學報, 2012, 28(2): 157-164.

[5] SHEPARD B M, BARRION A T, LISTINGER J A. Rice feeding insects of tropical Asia[M]. Philippines:IRRI,1995.

[6] 程家安. 水稻害蟲 [M]. 北京: 中國農業出版社,1996.

[7] 周奮啟，康曉霞，陳銀鳳，等．揚州市邗江區稻縱卷葉螟發生特點及防治技術[J]．江蘇農業科學，2016,44(3):140-145.

[8] 王 琳，包云軒，謝曉金，等．基于地統計法的稻縱卷葉螟時空變化特征[J]．江蘇農業學報，2017，33(1)：50-55.

[9] 龐 義,瀨涌流,劉 炬,等.稻縱卷葉螟顆粒體病毒[J]. 微生物學通報,1981, 8(3): 103-104.

[10] 張 珊,賈茜雯,孫士鋒,等.一株稻縱卷葉螟顆粒體病毒的系統發育和流行病學調查 [J]. 環境昆蟲學報, 2014,36(5): 756-776.

[11] XU J, LI C M, HAN G J, et al.Cnaphalocrocismedinalis(Guenée) Granulovirus, a potential microbial agent against the rice leaffolderCnaphalocrocismedinalisGüenée (Lepidoptera: Pyralidae) [J]. Egyptian Journal Biological Pest Control, 2016, 26(4): 675-681.

[12] HAN G J, XU J, LIU Q, et al. Genome ofCnaphalocrocismedinalisgranulovirus, the first crambidae-infecting Betabaculovirus isolated from rice leaffolder to sequenced [J]. PLoS ONE, 2016, 11(2): e0147882.

[13] 劉 琴,徐 健,王 艷,等. CmGV與Bt對稻縱卷葉螟幼蟲的協同作用研究 [J]. 揚州大學學報(農業與自然科學版), 2013,34(4): 89-93.

[14] XU J, LI C M, YANG Y J, et al. Growth and reproduction of artificially fedCnaphalocrocismedinalis[J]. Rice Science, 2012, 19(3): 247-251.

[15] PINDER J E, WIENER J G, SMITH M H. The weibull distribution: A new method of summarizing survivorship data [J]. Ecology, 1978, 59(5):175-179.

[16] 周郁斌,袁中文,李海剛,等. 用Origin軟件計算藥物溶出度Weibul1分布參數[J].醫藥導報, 2011, 30(6): 721-723.

[17] SOKAL R R, ROHLF F J. Biometry(3rd edition) [M]. New York: W H Freeman and Company, 1998.

[18] 龐雄飛. 害蟲種群的生態控制 [M]. 北京: 高等教育出版社, 2002.

[19] LACEY L A, THOMSON D, VINCENT C, et al. Codling moth granulovirus: a comprehensive review [J].BiocontrolScience and Technology, 2008, 18: 639-663.

[20] CORY J S, FRANKLIN M T. Evolution and the microbial control of insects [J]. Evolutionary Applications, 2012, 5(5): 455-469.

[21] HAN G J, LI C M, LIU Q, et al. Synergistic effect of combiningPlutellaxylostellagranulovirus andbacillusthuringiensisat sublethal dosages on controlling of diamondback Moth (Lepidoptera:Plutellidae) [J]. Journal of Economic Entomology, 2015, 108(5):2184-2195.

[22] 冼繼東,盧傳全,龐雄飛. 顆粒體病毒對小菜蛾種群控制作用的評價 [J]. 海南大學學報(自然科學版), 1997, 15(2): 138-140.

[23] FUXA J R. Ecology of insect nucleopolyhedroviruses [J]. Agriculture, Ecosystems and Environment,2004, 103(1): 27-43.

[24] CORY J S, MYERS J. The ecology and evolution of insect baculoviruses [J]. Annual Review of Ecology Evolution and Systematics, 2003, 34(1): 239-272.