小麥黃花葉病毒單克隆抗體的制備及ACP-ELISA檢測方法的建立

任春梅， 楊 柳， 繆 倩， 程兆榜

(江蘇省農業科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

小麥黃花葉病是由禾谷多黏菌(PolymyxagraminisL.)傳播的一種麥類土傳病毒——小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)引起的[1-2]，該病早在1927年就由日本的Sawada發現和報道[3]，至今仍對小麥的生產造成一定危害。在自然條件下，中國小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus, CWMV)與WYMV一樣易感染小麥，導致嚴重的田間病害[4]，且兩者常發生復合侵染，因病害癥狀極其相似，給鑒定工作帶來了一定難度。在中國，目前該病主要分布于淮河流域的河南、湖北、安徽、山東以及長江、黃河中下游的四川、陜西、江蘇、浙江等省，據2013年的統計，在中國的發生總面積達2.00×106hm2[5-7]，已經對中國的小麥產量和品質都造成了嚴重影響，因此急需建立一種能夠準確、規模化檢測該病毒的方法，為小麥黃花葉病的防控提供技術保障。

目前，針對WYMV的檢測主要有電鏡觀察、血清學、分子生物學等方法。早在2000年葉榮等就采用電鏡觀察法對WYMV的典型病毒粒子進行了診斷[8]，但此方法的儀器精密，價格昂貴；血清學檢測，Xing等以P2蛋白[9]、向榮等以P1蛋白[10]、韓成貴等以CP蛋白[11]的原核表達產物制備了相應抗血清，尚巧霞等[12]根據CP的原核表達建立了WYMV 的ELISA檢測系統，耿波等[13]利用異種動物抗血清建立了雙抗夾心ELISA 檢測技術，但這些血清學方法應用于田間大規模樣品的檢測還未見報道；分子生物學檢測，叢倩倩等[14]利用RT-PCR檢測了山東地區小麥黃花葉病的發生情況，繆倩等建立了一步法快速檢測WYMV和CWMV的RT-PCR方法， Tao等[15]建立了包括WYMV在內的小麥多種病毒的多重PCR檢測體系，Zhang等[16]建立了檢測WYMV的環介導等溫擴增技術體系，Fukuta等[17]建立了包括WYMV在內的土傳小麥花葉病毒多重RT-LAMP檢測體系，但該技術的應用受儀器設備和操作人員技術的限制，成本高，耗時長，不適于田間大量樣品的檢測。因此本實驗室利用蔗糖硫酸銫密度梯度離心法提純了WYMV病毒粒子，以此為抗原免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術獲得了3個分泌抗WYMV的雜交瘤細胞株，以此制備了WYMV的單抗腹水,并利用其中最靈敏的一株單抗建立了檢測WYMV的ACP-ELISA方法，成功地應用于田間小麥黃花葉病毒的檢測，為WYMV田間大規模快速檢測的實現提供了物質和技術支撐，從而推動小麥黃花葉病的預報預警和科學防控體系的建立。

1 材料和方法

1.1 毒源

WYMV毒源繁殖于江蘇省農業科學院植物保護研究所小麥黃花葉病旱池病圃，經RT-PCR鑒定后用于WYMV的提純，-70 ℃冰箱保存提純病毒。中國小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus, CWMV)和大麥黃花葉病毒(Barley yellow mosaic virus, BaYMV)經本實驗室鑒定后保存。

1.2 WYMV的提純

WYMV的提純參照任春梅等[18]的方法加以改進，先將約400 g小麥病葉和0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液置于攪拌機，攪碎后用兩層紗布過濾，濾液中加入300 ml 1/4四氯化碳攪拌5 min、靜置10 min，8 000 r/min離心15 min取上清液，加入6% PEG-6000、3% NaCl和1% Triton.X-100，冰浴攪拌至全部溶解，4 ℃下放置6 h或過夜，8 000 r/min離心20 min，沉淀用懸浮緩沖液懸浮，10 000 r/min離心15 min取上清液，上清液加5 ml 30%蔗糖墊(含0.3%Triton.X-100)，25 000 r/min離心2 h，沉淀用懸浮緩沖液懸浮，12 000 r/min離心10 min取上清液。進一步純化采用蔗糖硫酸銫不連續密度梯度離心法，以 22 000 r/min離心3 h，取離心管上端1/3處為病毒層，用樣品緩沖液稀釋，40 000 r/min離心1 h，沉淀用0.5 ml樣品緩沖液懸浮，即為所提純病毒溶液。提純病毒液經2%磷鎢(PTA)染色后置JEM-1200EX電鏡下觀察病毒粒子形態。以純化的WYMV病毒粒子作為抗原，制備抗WYMV的單克隆抗體。

1.3 小鼠免疫

參照Shang等[19]的免疫程序，選用7周齡左右雌性BALB/c小鼠6只，將提純的WYMV與等體積弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant, FC)混合，首次免疫采用皮下注射，2～3周后加強免疫1次，將抗原與弗氏不完全佐劑(Freund’s imcomplete adjuvant, FC)等體積混合，采用皮下及腹腔注射。4次免疫后采血檢測，通過間接ELISA方法確定抗血清的效價，待效價大于1∶10 000，選擇1～2只小鼠進行細胞融合。

1.4 細胞融合、篩選與亞克隆

1.4.1 細胞融合 首先依據Wu等[20]的方法，制備數量比為20∶1免疫小鼠的脾細胞和SP2/0鼠骨髓瘤細胞，再用DMEM基礎培養基稀釋細胞并用冷凍離心機離心棄上清，搖動離心管使細胞均勻，緩慢加入0.8 ml 50% PEG，反應90 s，加入20～30 ml DMEM培養基終止PEG，把融合的細胞放到37 ℃水浴鍋中反應10 min，再離心棄上清液加入HAT DMEM培養基，最后置于CO2培養箱中培養，融合10 d后開始篩選檢測。

1.4.2 融合篩選 檢測前1 d，用PBS包被5 μg/ml抗原于ELISA板，過夜。次日吸取細胞上清液1孔100 μl進行間接ELISA檢測，以提純的WYMV和感染WYMV的病葉為陽性，健康小麥葉片為陰性，根據ELISA結果，判斷是否陽性(樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1則判定為陽性)。用單道移液器挑檢整板檢測出的陽性孔，進行第二次ELISA確認檢測，確定后的陽性孔細胞進行亞克隆。

1.4.3 亞克隆 參考Wu等[20]的方法，將強陽性反應雜交瘤細胞進行3次連續細胞克隆，挑出穩定傳代細胞的單克隆擴大培養。

1.5 腹水制備和抗體純化

1.5.1 腹水制備 參考Wu等[20]的方法，將雜交瘤細胞懸液注射入小鼠腹腔，再收集腹部明顯膨大的小鼠腹水，離心取上清液即為腹水單克隆抗體，-20 ℃保存備用，待測定效價。

1.5.2 抗體純化 參照汪謙[21]采用的辛酸硫酸銨方法純化抗體，最后取少量進行效價測定。

1.6 抗體類型鑒定、效價測定和特異性分析

1.6.1 抗體類型及亞類鑒定 鑒定依據美國Sigma公司的抗體類型鑒定試劑盒操作說明進行。

1.6.2 抗體效價測定 將提純的WYMV用碳酸鹽包被液稀釋為1 g/ml作為抗原，一抗采用倍比稀釋的單抗，二抗應用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，參照Wu等[20]采用的間接ELISA方法測定腹水的效價。

1.6.3 Western blot分析單抗的特異性 選用WYMV和CWMV感染的小麥葉片、BaYMV感染的大麥葉片、健康小麥葉片為分析對象，參考劉歡等[22]的方法進行Western blot分析，SDS-PAGE電泳膠一部分用于考馬斯亮藍染色觀察，另一部分電轉移硝酸纖維素膜(NC)后與不同株單抗進行Western blot分析，測定單抗的特異性反應情況。

1.7 ACP-ELISA方法的建立

1.7.1 ACP-ELISA抗體最適工作濃度 根據劉歡等[22]的方法，利用WYMV的單克隆抗體建立其ACP-ELISA檢測方法。用方陣實驗確定單抗和酶標抗體的最適工作濃度。設置WYMV單抗濃度：4.000 μg/ml、2.000 μg/ml、1.000 μg/ml、0.500 μg/ml、0.250 μg/ml、0.125 μg/ml、0.062 μg/ml、0.032 μg/ml、0.016 μg/ml和0.008 μg/ml；HRP酶標記的羊抗鼠IgG二抗濃度：0.248 μg/ml、0.124 μg/ml、0.062 μg/ml、0.032 μg/ml、0.016 μg/ml、0.008 μg/ml、0.004 μg/ml和0.002 μg/ml，測定酶標儀上的OD450值。同時設健康小麥為陰性，每個處理3次重復。選取方陣中間OD450≈1.5，陰性,OD450<0.2對應的WYMV單抗和酶標二抗的稀釋倍數作為最佳工作濃度。

1.7.2 ACP-ELISA特異性分析 利用以上建立的ACP-ELISA檢測方法，測定WYMV感染小麥、CWMV感染小麥、BaYMV感染大麥病葉和健康小麥葉片在酶標儀上的OD450值，分析ACP-ELISA方法的特異性。

1.7.3 ACP-ELISA靈敏度分析 同上，以WYMV感染小麥病葉為陽性，健康小麥葉片為陰性，用0.01 mol/L的PBS(PH7.4)將小麥病葉從1∶100到 1∶102 400(g/ml)倍比稀釋，健康小麥葉片作同樣倍比稀釋，進行ACP-ELISA方法的靈敏度分析。

1.8 ACP-ELISA方法的檢測應用

應用建立的ACP-ELISA檢測方法，對采自于江蘇的高郵、寶應、儀征、常州、姜堰、興化、鹽都、淮安和大豐，安徽的壽縣和來安，河南的遂平，山東的臨沂、泰安和濟寧等的小麥中小麥黃化葉病疑似樣品進行檢測，用溫室生長的小麥健康葉片為陰性對照，病圃中經檢測為小麥黃化葉病病葉為陽性對照，每個處理設3個重復，以P/N>2.1作為陽性判斷標準。再對每個樣品用RT-PCR方法進行驗證，觀察并記錄結果。

2 結果與分析

2.1 小麥黃花葉病毒的提純

用改進的方法提純小麥黃花葉病毒樣品，經2%磷鎢酸負染后在透射電鏡下觀察到較純且濃密的病毒粒子(圖1)，粒子形狀呈直線狀，長度約200 nm，直徑約13 nm。用紫外分光光度法測得的濃度為5.44 mg/ml。

圖1 WYMV病毒粒子的電鏡觀察Fig.1 Electron microscopic observation of wheat yellow mosaic virus (WYMV) particles

2.2 雜交瘤細胞的融合率、陽性率和克隆

提純的WYMV免疫小鼠，經融合、篩選和培養后，18塊96孔板細胞的融合率達到100%。當雜交瘤細胞生長至覆蓋孔底 20～30%時，以提純病毒為包被抗原采用間接ELISA方法對融合細胞進行陽性篩選，結果顯示陽性率為9.5%。利用有限稀釋法對5個陽性反應強、特異性好的雜交瘤細胞進行3次細胞克隆，最終獲得6F4、2D3和2D4共3株生長良好且能穩定分泌抗WYMV的單抗雜交瘤細胞株。

2.3 抗體的制備和特性鑒定

用克隆好的雜交瘤細胞注射BALB/c小鼠腹腔，采集腹水，最終3個細胞株各獲得約25 ml腹水。3株腹水純化后的IgG含量在1.45～3.10 mg/ml(表1)，經試劑盒鑒定，3個抗體均為IgG1、κ鏈，間接ELISA方法測得3株腹水單抗的效價達 10-7～10-6(表1)。

表1WYMV單克隆抗體(MAbs)的特性

Table1Propertiesofmonoclonalantibodies(MAbs)againstWYMV

單克隆抗體單克隆抗體類型單克隆抗體腹水效價IgG含量(mg/ml)6F4IgG1,κ鏈10-61.452D3IgG1,κ鏈10-62.302D4IgG1,κ鏈10-73.10

2.4 單抗的特異性分析

Western blot結果表明，6F4和2D4兩株抗體均能與WYMV病葉中1條約32 kD的蛋白亞基結合，而在CWMV和BaYMV病葉、健康小麥葉片中均沒有出現任何條帶(圖2)，說明這兩株單抗均能與WYMV外殼蛋白亞基特異性結合。2D3抗體在WYMV、CWMV、BaYMV病葉、健康小麥葉片中均未檢測到任何條帶，但ACP-ELISA檢測時2D3抗體與WMVY病毒呈陽性反應，故推測2D3單抗是針對WYMV構象型的抗原決定簇，具有一定的空間構象，其空間結構由于電泳過程中的變性而被破壞，使得單抗不能與抗原結合。

2.5 ACP-ELISA法的條件優化

經方陣實驗， ACP-ELISA法中6F4、2D4和2D3的3個單抗的最適工作濃度分別為0.50 μg/ml、0.25 μg/ml和2.00 μg/ml，酶標二抗的最適工作濃度為0.062 μg/ml。

M：蛋白marker；1、5和9：WYMV感染小麥病葉提取液；2、6和10：CWMV感染小麥病葉提取液；3、7和11：BaYMV感染大麥病葉提取液；4、8和12：健康小麥葉片提取液。圖2 WYMV單克隆抗體(MAbs)與病毒衣殼蛋白的Western blot分析Fig.2 Western blot analysis of WYMV coat protein with monoclonal antibodies(MAbs)

2.6 ACP-ELISA法的特異性分析

3個抗體建立的ACP-ELISA法的特異性分析見圖3，結果顯示3個單抗的ACP-ELISA檢測中，只有WYMV感染病葉出現了強陽性反應，而CWMV和BaYMV感染病葉與健康小麥葉片為陰性反應，說明這3種單抗建立的ACP-ELISA方法均具有很好的特異性。

W：WYMV感染的小麥葉片；C：CWMV感染的小麥葉片；B：BaYMV感染的大麥葉片；CK：健康小麥葉片。圖3 ACP-ELISA的特異性Fig.3 Specificity of the ACP-ELISA

2.7 ACP-ELISA法的靈敏度

靈敏度分析結果表明，以2D4單抗建立的ACP-ELISA檢測病葉的靈敏度最高，當小麥病葉以1∶25 600倍稀釋時，仍呈陽性反應；而以6F4和2D3單抗建立的ACP-ELISA檢測病葉的靈敏度稍差(圖4)。

圖4 ACP-ELISA的靈敏度Fig.4 Sensitivity of the ACP-ELISA

2.8 ACP-ELISA法的檢測應用

應用最靈敏的2D4單抗建立的ACP-ELISA檢測方法對采自中國4個省15個縣、市的60個樣品進行檢測，結果見表2。由表可知，WYMV的分布廣泛，除江蘇的淮安、大豐和儀征三地的小麥樣品中未檢到外，其余12個縣、市均有分布，陽性檢出率在63.63%以上，說明WYMV目前仍是麥子上較為流行的主要病毒。同時，小麥樣品進一步用RT-PCR檢測驗證，結果表明與ACP-ELISA檢測的陽性結果高度一致(圖5)，此外，陽性RT-PCR產物經核酸測序驗證均為WYMV。說明本研究建立的檢測WYMV的ACP-ELISA方法能夠可靠、準確地用于小麥中WYMV的檢測。

3 討 論

單克隆抗體(monoclonal antibody, MAb)是由一個B淋巴細胞產生的針對一種抗原決定簇的抗體，因其特異性強、靈敏度高、可無限量生產等特點而被廣泛應用，目前已被應用于生物學和醫學的各個研究領域，促進了細胞學、遺傳學、免疫學和病毒學等眾多學科的發展[23]。自1982年西德科學家成功研制了煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)的單克隆抗體，目前單抗在植物病毒學的檢測方面得到了廣泛應用。國內外學者已經制備了水稻、玉米、蔬菜等作物上幾十種植物病毒的單抗，大部分都已應用于田間樣品的檢測，對控制病毒病害在田間的發生，減少經濟損失，抗病篩選和病害流行預測都起到了十分重要的作用。

表2ACP-ELISA法檢測田間疑似小麥黃化葉病樣品結果

Table2DetectionresultsoffieldwheatsamplestestedbyACP-ELISA

采集地點樣品數(個)陽性數(個)ACP-ELISART-PCR吻合率(%)江蘇高郵322100江蘇寶應111100江蘇儀征500100江蘇常州444100江蘇姜堰744100江蘇興化555100江蘇鹽都111100江蘇淮安300100江蘇大豐700100安徽壽縣333100安徽來安222100河南遂平544100山東臨沂333100山東泰安444100山東濟寧211100

A: ACP-ELISA檢測方法;B: RT-PCR檢測方法;M：DNA分子量marker；1-9：田間小麥樣品；10：WYMV感染小麥樣品(陽性對照)；11：健康小麥樣品(陰性對照)；圖中擴增帶均為520 bp WYMV目的條帶。圖5 ACP-ELISA法(A)和RT-PCR法(B)檢測結果的吻合度Fig.5 Detection results of field wheat samples tested by ACP-ELISA(A) and RT-PCR(B)

近幾年，隨著耕作制度和推廣品種的交替變化，小麥黃花葉病在山東、河南、江蘇、安徽等冬小麥上發生仍然嚴重[24-25]，因此亟待尋找到控制該病害的有效方法。其中病害的預測預報是前提，抗病品種的應用是首選，這些策略都會產生大量需要檢測的樣品。因為田間小麥黃花葉和小麥花葉病毒病的發病癥狀極其相似，而且常常發生復合侵染、隱癥等現象，生物學方法不可有效鑒定。雖然分子生物學方法的靈敏度強且特異性好，但其需要更高的成本和更精密的儀器，且對操作者的要求比較高，所以一般只局限于實驗室使用。綜合而言，血清學方法的操作相對簡便，且具有特異性好、靈敏度高、成本低等特點，所以更適用于大規模田間樣品的檢測，也易于在基層進行推廣。基于此，本研究從自建的小麥黃花葉病病圃中采集了大量病葉，用蔗糖硫酸銫密度梯度離心提純病毒，免疫小鼠，通過雜交瘤技術得到了3株能高效分泌WYMV的單克隆抗體細胞株并制備了單抗腹水，其效價達10-7～10-6，以其為核心建立了檢測WYMV的ACP-ELISA方法，其檢測病葉的靈敏度達1∶25 600倍稀釋，且特異性強。利用建立的ACP-ELISA方法測定中國小麥主產區小麥黃花葉病的發生情況，檢測結果發現WYMV的感染率高達63.64%，說明該病仍是當下小麥上極易發生的病毒病害，應引起相關部門足夠的重視，也提示我們快捷、高效、低成本檢測方法研制的必要性。該方法雖不及RT-PCR法的檢測靈敏度高，但檢出率與其一致，說明其檢測的可靠性。相比于多抗建立的檢測方法，其具有特異性高、均質性好，且只要得到1株好的細胞株就可以無限量生產等優點。強特異性能有效解決田間WYMV和CWMV復合感染不易區分的難題，這在田間應用中的優點尤為明顯。總之，以單抗為核心建立的ACP-ELISA方法具有操作簡便、準確性強、易標準化和大規模生產等特點，可有效應用于田間小麥WYMV的檢測，對該病毒病的診斷、預測、預報及防控具有重要意義。

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