miR—1203和HOTAIRrs7958904位點對乳腺癌細胞生長的影響

劉文輝+肖堅+孫維華

[摘要] 目的 探討長鏈非編碼RNA HOTAIR多態位點rs7958904的遺傳變異與miR-1203的關系及兩者在乳腺癌細胞生長中的作用。 方法 分別將HOTAIR rs7958904野生型和突變型克隆進雙熒光素酶報告載體和過表達載體，雙熒光素酶報告載體分別和miR-1203模擬物共轉染細胞，檢測熒光素酶的表達。過表達載體、miR-1203模擬物或抑制物單獨或共轉染乳腺癌細胞，熒光定量PCR檢測HOTAIR表達，BrdU檢測細胞增殖，Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡，Transwell法檢測細胞侵襲。 結果 HOTAIR突變型增強了miR-1203對其的靶向結合；miR-1203可以下調突變型HOTAIR的表達，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；但對野生型HOTAIR影響不顯著（P > 0.05）。野生型HOTAIR明顯促進乳腺癌細胞的增殖侵襲和抑制其凋亡，突變型HOTAIR的上述作用明顯減弱且可以被miR-1203阻斷，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）；miR-1203具有與HOTAIR相反的作用，抑制miR-1203表達后，突變型HOTAIR具有與野生型HOTAIR類似的效果。 結論 HOTAIR rs7958904的突變型能下調HOTAIR的功能，此作用可能是增加了miR-1203的結合位點導致的。此發現將為lncRNA SNP功能的研究探討提供新的研究方向。

[關鍵詞] 長鏈非編碼RNA；HOTAIR；乳腺癌；miR-1203；單核苷酸多態性

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（c）-0008-05

[Abstract] Objective To investigate the association between genetic variation of lncRNA HOTAIR SNP rs7958904 and miR-1203， as well as to explore their roles in the growth of breast cancer （BC） cells. Methods The wild type and mutant HOTAIR SNP rs-7958904 were both cloned into the Dual-Luciferase Reporter Vector and Over-expression vector， respectively. The Dual-Luciferase Reporter Vectors and miR-1203 mimics were co-transfected into the cells， and then the luciferase expression was detected. Furthermore， BC cells were transfected with the overexpression vector and/or miR-1203 mimics/inhibitors. And then， HOTAIR expression was detected by fluorescent quantitative PCR， cell proliferation was assessed by BrdU， cell apoptosis was tested by Annexin V-FITC/PI， and cell invasion was examined by Transwell Assay. Results The binding of miR-1203 and HOTAIR was enhanced by mutant HOTAIR； miR-1203 could down-regulate the expression of mutant HOTAIR （P < 0.01）， but such down regulation on wild-type HOTAIR was insignificant （P > 0.05）. The wild-type HOTAIR promoted the proliferation and invasion of BC cells significantly but inhibit their apoptosis （P < 0.01）； whereas such effect of the mutant HOTAIR declined obviously and could be blocked by miR-1203. miR-1203 had the opposite effect of HOTAIR； when the expression of miR-1203 was inhibited， the mutant HOTAIR exhibited a similar effect as wild-type HOTAIR. Conclusion The mutant HOTAIR rs7958904 can down-regulate the activity of HOTAIR， and such down regulation may probably associated with the increment of miR-1203 binding sites. This finding could provide a new direction for the future study in the function of lncRNA SNPs.

[Key words] lncRNA； HOTAIR； Breast cancer； miR-1203； SNPendprint

乳腺癌（breast cancer，BC）是女性腫瘤中最常見的一種，其發病率在各種女性惡性腫瘤中居于首位，并且逐年上升[1]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種無蛋白編碼能力的功能性RNA分子，研究表明lncRNA在腫瘤發生發展中發揮重要作用[2]。目前研究發現，同源盒基因轉錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）在大多數腫瘤中呈現高表達，且在腫瘤中發揮重要作用[3-5]。

LncRNA的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）不單會改變lncRNA的結構和穩定性而影響其表達，也有可能影響miRNA-lncRNA間的相互作用而調控其功能發揮，從而影響個體的腫瘤易感性[6-8]。但目前關于lncRNA SNP與乳腺癌間的關聯研究還很少，因此探討lncRNA SNP在個體乳腺癌易感性中的研究具有重大意義。根據預測，HOTAIR rs7958904位點上的G/C突變可增加miR-1203的結合位點。因此，本研究具體探討HOTAIR rs7958904位點是否能通過miR-1203而影響乳腺癌細胞的生長及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人乳腺癌MDA-MB-231細胞購自美國ATCC細胞庫，用含10%胎牛血清（購自杭州四季青）和雙抗的RPMI-1640培養基（購自Gibco公司）置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中進行培養，每隔3 d用胰酶消化傳代。

1.2 過表達載體構建和轉染

HOTAIR野生型過表達載體購自廣州復能公司，突變型HOTAIR過表達載體用QuikChangeⅡSite-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）試劑盒進行。轉染前1 d，細胞接種6孔板，接種濃度為1×105個細胞/mL，每孔1 mL；第2天當細胞匯合度達到70%左右時進行轉染，質粒轉染量為4 μg/孔，步驟參考Lipofectamine 2000（Invitrogen）說明書進行；轉染后4～6 h換液，48 h后進行后續實驗檢測。

1.3 雙熒光素酶報告基因檢測

HOTAIR野生型和突變型全長序列分別克隆到雙熒光素酶報告載體psiCHECK-2（Promega）中，然后分別和miR-1203模擬物（購自廣州市銳博生物科技有限公司）共轉染細胞。轉染48 h后，用雙熒光素酶報告基因檢測系統（Promega）進行熒光強度測定，用螢火蟲熒光素酶為內參進行校正，從而得出相對的熒光強度比，并將數據進行分析。

1.4 熒光定量PCR

收集細胞用Trizol提取總RNA，定量后用1 μg RNA進行逆轉錄，SYBR-Green染料法（SYBR Green PCR Master Mix購自TOYOBO）進行定量PCR，20 μL體系含100 ng cDNA。反應條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 cycles。每個樣重復3次，定量分析通過比較2-ΔΔCt值進行。

1.5 細胞增殖

用BrdU ELISA kit（Roche）進行檢測。細胞接種于96孔板中，轉染后繼續培養48 h。去除培養基，加入20μL BrdU標記液，繼續培養3 h細胞固定后，加入過氧化物酶標記的BrdU抗體孵育90 min。繼續加入過氧化物酶底物，在酶標儀上以370 nm/492 nm 雙波長檢測吸光值，即BrdU摻入量。每組設3個復孔。

1.6 細胞凋亡

轉染48 h后收集細胞，按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）說明書操作，加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應5～15 min，用流式細胞儀進行檢測，實驗重復3次。

1.7 細胞侵襲

往Transwell小室中鋪上Matrigel（BD），細胞轉染后第二天進行懸浮，調整細胞密度至1×106個細胞/mL，取200 μL加入Transwell小室上室，在下室加入600 μL完全培養基；37℃、5% CO2孵育48 h后，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌1次，結晶紫染色10 min，PBS洗滌1次，拍照計數分析。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，采用析因設計方差分析比較各組間體外細胞增殖、凋亡及侵襲能力的差異；采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較各組熒光定量PCR檢測結果；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HOTAIR SNP rs7958904對miR-1203靶向結合的影響

利用lncRNA SNP在線預測軟件分析HOTAIR多態性與miRNA間的匹配關系，結果發現rs7958904 G>C等位基因突變可增加一個新的miR-1203結合位點（圖1A）。進一步的雙熒光素酶報告基因實驗表明（圖1B），突變型HOTAIR載體與miR-1203共轉染時，熒光素酶表達較NC miRNA轉染組明顯下調，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；野生型HOTAIR載體與miR-1203共轉染時，熒光素酶表達下調并不顯著（P > 0.05）。這說明，G>C等位基因突變可明顯增強miR-1203與HOTAIR的結合。

2.2 不同亞型HOTAIR的表達

分別將HOTAIR野生型和突變型過表達載體轉染乳腺癌細胞，HOTAIR表達均上調明顯（P < 0.01），但突變型HOTAIR轉染組上調程度顯著低于野生型HOTAIR轉染組（P < 0.01，圖2A）。上述質粒與miR-1203模擬物共轉染時，miR-1203能顯著抑制突變型HOTAIR促進HOTAIR表達的作用（P < 0.01），但對野生型HOTAIR的影響并不顯著（圖2A）。共轉染突變型HOTAIR和miR-1203抑制物時，HOTAIR的表達較Control組上調更明顯（P < 0.01），與野生型HOTAIR轉染組效果相似（圖2A）。因此，miR-1203可以靶向調控突變型HOTAIR的表達。endprint

2.3 miR-1203和不同亞型HOTAIR對細胞增殖的影響

單獨轉染miR-1203模擬物時，乳腺癌細胞增殖明顯下調，而野生型和突變型HOTAIR均會促進乳腺癌細胞的增殖，但突變型HOTAIR的促增殖效果明顯低于野生型HOTAIR（圖2B），以上差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。野生型HOTAIR與miR-1203模擬物共轉染時，細胞增殖仍呈上調趨勢（P < 0.01），略低于野生型HOTAIR轉染組（圖2B）。突變型HOTAIR與miR-1203模擬物共轉染時，細胞增殖變化并不明顯（P > 0.05），只是略低于對照組（圖2B）。而突變型HOTAIR與miR-1203抑制物共轉染時，細胞增殖顯著增強（P < 0.01），與野生型HOTAIR轉染組相似（圖2B）。因此，miR-1203可以靶向調控突變型HOTAIR而影響細胞增殖。

2.4 miR-1203和不同亞型HOTAIR對細胞凋亡的影響

進一步檢測細胞凋亡，結果發現，野生型和突變型HOTAIR均能下調乳腺癌細胞的凋亡率；而miR-1203具有相反的作用，能顯著促進細胞凋亡（圖3），差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。miR-1203能抑制突變型HOTAIR的抑凋亡作用（P < 0.01），但對野生型HOTAIR的影響并不顯著（圖3）。而轉染突變型HOTAIR的同時抑制miR-1203表達后，細胞凋亡被抑制（P < 0.01），與野生型HOTAIR轉染組類似（圖3）。這表明，miR-1203可以通過靶向抑制HOTAIR的表達而影響HOTAIR的功能發揮。

2.5 miR-1203和不同亞型HOTAIR對細胞侵襲的影響

利用Transwell方法檢測乳腺癌細胞的侵襲行為，結果見圖4。miR-1203能顯著抑制乳腺癌細胞的侵襲，而野生型HOTAIR顯著促進乳腺癌細胞的侵襲。突變型HOTAIR也具有促進細胞侵襲的作用，但效果明顯低于野生型HOTAIR轉染組，以上差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。共轉染野生型HOTAIR與miR-1203模擬物時，細胞侵襲仍然顯著增加（P < 0.01）；共轉染突變型HOTAIR與miR-1203模擬物時，細胞侵襲與對照組比較差無統計學意義（P > 0.05）。但共轉染突變型HOTAIR與miR-1203抑制物時，細胞侵襲顯著下調（P < 0.01）。因此，miR-1203可以靶向調控突變型HOTAIR表達而抑制細胞侵襲。

3 討論

隨著研究的深入，lncRNA的遺傳多態性與個體腫瘤的易感性間存在莫大關聯。本研究也表明HOTAIR rs7958904遺傳變異會影響HOTAIR功能發揮。Guo等[9]發現，HOTAIR的rs12826786位點發生遺傳變異時會影響HOTAIR的轉錄表達。而Zhang等[10]研究表明rs920778 C→T突變能促進HOTAIR的轉錄表達。上述研究均表明，lncRNA遺傳多態性確實能影響其本身功能發揮，從而在各種腫瘤發生發展中發揮作用。

研究進一步發現，HOTAIR rs7958904突變后會增加miR-1203的結合位點。miR-1203下調突變型HOTAIR的作用，而對野生型HOTAIR影響不明顯。當抑制miR-1203表達后，突變型HOTAIR具有與野生型類似的功能。Wu等[11]發現lincRNA-uc003opf.1位點rs11752942的G等位基因能夠增加miR-149的結合位點，從而受miR-149的調控而抑制自身的表達，進而影響細胞分化和腫瘤生長。上述研究均說明，lncRNA遺傳多態性影響自身功能的一種手段是改變了一些相關miRNAs對自身的調控作用，進而對腫瘤細胞的生長產生影響。本研究同時證明，miR-1203具有抑癌功能，其過表達可以抑制乳腺癌細胞增殖侵襲，而抑制其凋亡。有研究表明，miR-1203在腎細胞癌、胰腺癌和食管鱗癌中表達下調[12-14]，并在非小細胞肺癌中呈現甲基化[15]。因此，miR-1203有可能是一種抑癌基因。

綜上所述，HOTAIR rs7958904突變會增加抑癌基因miR-1203的結合，從而受miR-1203的調控而影響其功能發揮。這為lncRNA遺傳多態性功能變化的研究提供了新思路。

[參考文獻]

[1] DeSantis C，Ma J，Bryan L，et al. Breast cancer statistics，2013 [J]. CA Cancer J Clin，2014，64（1）：52-62.

[2] 李穩，馬欣，汪靜，等.長鏈非編碼RNA在乳腺癌中的研究進展[J].現代生物醫學進展，2016，16（21）：4174-4180.

[3] 趙晗婷，林超逸，徐迎春，等.lncRNAs在乳腺癌發生、發展中的作用及其潛在的臨床意義[J].臨床腫瘤學雜志，2016，21（8）：736-743.

[4] Meng J，Li P，Zhang Q，et al. A four-long non-coding RNA signature in predicting breast cancer survival [J]. J Exp Clin Cancer Res，2014，33：84.

[5] 王慧霄，代蔭梅.長鏈非編碼RNA HOTAIR與腫瘤發生發展的研究進展[J].醫學綜述，2017，23（9）：1680-1684.

[6] Yan R，Cao J，Song C，et al. Polymorphisms in lncRNA HOTAIR and susceptibility to breast cancer in a Chinese population [J]. Cancer Epidemiol，2015，39（6）：978-985.endprint

[7] Xue Y，Gu D，Ma G，et al. Genetic variants in lncRNA HOTAIR are associated with risk of colorectal cancer [J]. Mutagenesis，2015，30（2）：303-310.

[8] Li N，Zhou P，Zheng J，et al. A polymorphism rs12325489C>T in the lincRNA-ENST00000515084 exon was found to modulate breast cancer risk via GWAS-based association analyses [J]. PLoS One，2014，9（5）：e98251.

[9] Guo W，Dong Z，Bai Y，et al. Associations between polymorphisms of HOTAIR and risk of gastric cardia adenocarcinoma in a population of north China [J]. Tumour Biol，2015，36（4）：2845-2854.

[10] Zhang X，Zhou L，Fu G，et al. The identification of an ESCC susceptibility SNP rs920778 that regulates the expression of lncRNA HOTAIR via a novel intronic enhancer [J]. Carcinogenesis，2014，35（9）：2062-2067.

[11] Wu H，Zheng J，Deng J，et al. A genetic polymorphism in lincRNA-uc003opf.1 is associated with susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma in Chinese populations [J]. Carcinogenesis，2013，34（12）：2908-2917.

[12] Zhu J，Ma X，Zhang Y，et al. Establishment of a miRNA-mRNA regulatory network in metastatic renal cell carcinoma and screening of potential therapeutic targets [J]. Tumour Biol，2016，37（12）：15 649-15 663.

[13] Hou BH，Jian ZX，Cui P，et al. miR-216a may inhibit pancreatic tumor growth by targeting JAK2[J]. FEBS Lett，2015，589（17）：2224-2232.

[14] Okumura T，Kojima H，Miwa T，et al. The expression of microRNA 574-3p as a predictor of postoperative outcome in patients with esophageal squamous cell carcinoma [J]. World J Surg Oncol，2016，14（1）：228.

[15] Heller G，Weinzierl M，Noll C，et al. Genome-wide miRNA expression profiling identifies miR-9-3 and miR-193a as targets for DNA methylation in non-small cell lung cancers [J]. Clin Cancer Res，2012，18（6）：1619-1629.

（收稿日期：2017-10-10 本文編輯：任 念）endprint