微流控芯片富集鼻咽癌細胞的實驗研究

陳文學 李金高 程為良 萬祥輝 齊淑軼 張宇晴 翁秋敏 李俊玉 熊文敏 謝 琛

鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤之一，由于早期癥狀不明顯，就診時大部分已是中晚期。鼻咽癌的治療手段主要是放射治療，在患者進行根治性放射治療后有40%～60%會有鼻咽部或(和)頸部復發，復發多見于放射治療后的2～3年內。

鼻咽癌復發轉移是導致死亡的直接原因。目前鼻咽癌復發轉移的主要檢查方法是影像學檢查，只有在復發和轉移的腫瘤形成一定的體積時候影像學才能夠成像，此時已經失去的腫瘤治療的最好機會。腫瘤在形成復發轉移之前腫瘤細胞已經在血中播散，外周血中的這種腫瘤細胞稱為循環腫瘤細胞(CTC)[1]。腫瘤的負荷與血液中的CTC有直接關系，因此檢測CTC可以反映腫瘤的狀態。[2]

本研究采用前期篩選出的適配子結合微流體裝置捕獲外周血鼻咽癌細胞從而實現對鼻咽癌的無創診斷。

1 材料與方法

1.1 資料

2016年11月至2017年5月本院收治的鼻咽癌初治患者20例，男性13例，女性7例，中位年齡 43 (32～72)歲。全部患者經鼻咽活檢病理證實為鼻咽癌，病理類型均為低分化鱗癌。所有患者均接受鼻咽、頸部CT掃描，電子鼻咽鏡及胸部正側位片，腹部B超及相關實驗室檢查以明確分期及遠處轉移，若患者有骨痛癥狀則行全身骨掃描。臨床分期按92分期標準進行TNM分期。健康體檢者20例，其中男性10例，女性10例，中位年齡32歲。

1.2 微流體芯片的制備

PDMS 微流控芯片制作由蘇州文灝芯片科技有限公司生產。通過光刻工藝制作SU-8模具，采用PDMS脫模工藝制作PDMS陣列 基片和蓋片，通過鍵合工藝形成封閉微流體芯片。芯片由進樣口、反應室、出樣口組成，反應室內設置叉排的微繞流柱，微繞流柱為圓形，直徑為45 μm，間距為100 μm。

1.3 微流體芯片的內部修飾

通過兩步法將生物素標記的適配子,首先通過物理吸附將親和素(Invitrogen公司)結合到微流體芯片的反應室內壁上，通過生物素親和素反應將標記由生物素的適配子固定在反應室內表面。通過熒光顯微鏡判斷適配子固定在反應室的情況。

1.4 細胞培養

人鼻咽癌細胞 (C666)、正常人鼻咽上皮細胞(NP69)本室保存。無血清培養基keratinocyte-SFM、1640培養基、胎牛血清購自 GIBICO 公司。C666細胞用含有10%熱滅火胎牛血清100IU/ml青鏈霉素的1640培養基培養，NP69細胞用keratinocyte-SFM無血清培養基進行培養。所有培養的細胞均用DPBS磷酸緩沖液洗滌2次后用0.25%胰蛋白酶消化傳代或收獲細胞。

1.5 適配子緩沖液

適配子由大連寶生物合成。適配子序列如下FITC-5`-ACCGACCGTGCTGGACTCTACCGCGCAGTGAGGTGAGTGGGGTAGGTTGTTACGTTTCCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3`-Biotin。洗脫緩沖液： 4.5 g/L葡萄糖，5 mM MgCl2的DPBS磷酸緩沖液。結合緩沖液： 0.1 mg/ml 酵母 tRNA，1 mg/ml BSA 的洗滌緩沖液。捕獲緩沖液：結合緩沖液和淋巴細胞分離液以1∶1比例混合組成。

1.6 細胞捕獲實驗

細胞捕獲實驗前先將細胞懸液調整濃度到106/ml，用vybrant DiI或DiD細胞染色液進行染色。染色步驟按照說明書進行，細胞在37 ℃染色5 min，洗滌緩沖液洗滌一次，用捕獲緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度到106/ml，儲存在冰上備用。

細胞捕獲實驗的步驟首先用1 mg/ml親和素在微流控芯片中作用1 min，結合緩沖液沖洗3次。30 μM生物素標記適配子作用1 min，用結合緩沖液沖洗3次。微泵泵入細胞混懸液(C666和NP69)到微流體芯片反應室內，結合緩沖液沖洗3次，洗脫緩沖液洗脫，熒光顯微鏡觀察捕獲細胞的數量。

1.7 微流體芯片捕獲全血中鼻咽癌細胞

全血取自健康體檢者的EDTA抗凝血。胰蛋白酶會對細胞產生較大損失，因此制備細胞懸液采用無酶細胞消化液進行消化細胞，獲得的單個鼻咽癌細胞加入健康體檢者全血中，通過微流體芯片捕獲鼻咽癌細胞，計算最終鼻咽癌細胞捕獲效率。全血中鼻咽癌細胞的終濃度為10、100、1 000、10 000個細胞/ml，每個濃度重復3次。

用微泵將細胞懸液或全血標本經過微流體裝置的進樣口輸送到反應室，連接反應室出樣口的是細胞收集器。為了避免全血的性狀改變，全血腫瘤細胞分離過程中沒有加入緩沖液。為防止細胞在泵入過程中濃度不均一，在細胞出入端全血中放入微型磁力攪拌棒，全血細胞在出入過程中不會下沉且保持濃度均一。

1.8 臨床標本的收集及檢測

抽取患者及健康體檢者5 ml外周血置于 EDTA抗凝管，4 ℃保存備用。用1.6的方法捕獲保存的外周血細胞，洗脫反應室內細胞離心計數。統計學方法采用t檢驗。

2 結果

2.1 微流體對靶細胞的分離

用鼻咽癌細胞C666作為靶細胞，鼻咽正常細胞NP69作為對照細胞，用結合了生物素標記的適配子的微流體可以實現對鼻咽癌細胞的富集。1 ml的樣本中含有靶細胞與對照細胞的比為1∶1 000，終細胞數為106，實驗前分別對兩種細胞進行預染，鼻咽癌細胞C666用Vybrant DiI預染，染色后細胞顏色為紅色，鼻咽正常細胞NP69用Vybrant DiD 染色，染色后細胞顏色為藍色。經過微流體芯片富集后熒光顯微鏡計數靶細胞的捕獲效率達到96%。

2.2 全血鼻咽癌細胞的分離

模擬分離患者外周血中循環腫瘤細胞，將培養的鼻咽癌細胞加入到收集的外周血中，1 ml外周血中加入不等數量的鼻咽癌細胞C666，用微流體裝置進行鼻咽癌細胞分離富集，鼻咽癌細胞的捕獲效率均可以達到90%以上，不同細胞含量的的微流體捕獲細胞數量如圖1，從圖上可以看出微流體裝置檢測外周血的范圍為10～10 000個。

2.3 初治鼻咽癌患者外周血檢測結果

比較鼻咽癌患者和健康體檢者外周血經過微流體芯片檢測收獲的細胞，發現鼻咽癌患者外周血收獲的細胞數明顯高于健康體檢者，統計學有顯著差異(P<0.01)，見圖2。

圖1 全血標本中鼻咽癌細胞捕獲范圍

圖2 鼻咽癌初治患者和健康對照組捕獲細胞比較

3 討論

腫瘤的液態活檢是目前腫瘤診斷與治療研究的熱點，腫瘤患者的外周血循環腫瘤細胞可以通過多種檢測手段進行檢測[3-4]。目前對CTC的檢測方法主要有①流式熒光檢測儀(Luminex100TM多功能流式點陣儀)，主要檢測乳腺癌外周血中8種循環腫瘤細胞基因；②免疫磁珠分離細胞，將單抗連接在磁珠上對靶細胞進行分離，可以從106-7單核細胞中分離出1個腫瘤細胞；③基于免疫磁性分離原理發展起來的CellSearch系統[5]，它是一種半自動的CTC檢測儀，將epCAM包被于磁珠表面分離CTC,目前已被美國FDA批準用于監測乳腺癌預后及治療效果;④膜過濾法，通過腫瘤細胞體積大于外周血細胞而把腫瘤細胞分離出來，再用抗體標記識別腫瘤細胞。以上這些方法(除基因檢測外)主要采用在具有高親和力的抗體(CK8、 CK18、CK19、epCAM)捕獲計數CTC[6-8]。目前鑒定出能夠結合腫瘤細胞或腫瘤細胞株的抗體非常少，抗體存在高水平的脫靶交叉反應[9]，需要特定的條件保持蛋白探針的功能活性是以抗體為基礎的捕獲CTC方法的主要缺陷，同時也限制了這項技術在臨床中對多種腫瘤的檢測。

相對于抗體適配子具有更好的親和力更高的特異性，容易合成保存運輸，可以進行表面修飾，因此近年來也有報道適配子捕獲外周血腫瘤細胞,其外周血腫瘤細胞的捕獲效率從70%到98%不等[10-12]。本研究通過前期研究篩選出的鼻咽癌適配子[13]結合微流體平臺實現了對鼻咽癌外周血腫瘤細胞的檢測，鼻咽癌細胞的捕獲效率達到90%，優于一些研究報道的腫瘤細胞捕獲效率[14]。

本研究證實了以適配子為基礎的微流體可以分離全血中的腫瘤細胞，通過用微繞流芯片對臨床標本和健康對照組進行檢測，發現20例健康對照組外周血中捕獲細胞數為0到1，鼻咽癌初治患者照外周血捕獲細胞數從2個到93個不等，對發現鼻咽癌細胞數適配子微流體以其檢測標本不需要預處理，檢測速度快，檢測下線低等優勢將在臨床診斷中有廣闊的前景。

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