八寶丹抑制胃癌細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

尚海霞 ，楊 弘 ，靳祎祎 ，彭 軍 ，2，褚劍鋒 ，2，莊群川 ，2，林久茂 ，2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

胃癌是起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是世界上常見的惡性消化道腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康［1］。近年來其發(fā)病率逐年上升，并呈年輕化趨勢［2］。目前胃癌的主要治療方法有手術(shù)、化療、放療等，化療易對藥物產(chǎn)生耐藥性而使患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，臨床療效不佳，成為腫瘤治療的疑難點(diǎn)。中醫(yī)藥治療惡性腫瘤療效顯著，毒副作用小，具有整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，成為腫瘤治療的重要手段，備受關(guān)注。八寶丹（BBD）在臨床上治療胃癌等惡性腫瘤，可提高癌癥患者的化療耐受、減輕化療藥物的毒副反應(yīng)、提高生活質(zhì)量、延長生存期等［3］。但八寶丹對胃癌細(xì)胞的抑制作用及其分子機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，探討八寶丹對胃癌細(xì)胞AGS和MGC-803增殖的抑制作用及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株AGS和MGC-803購自中科院上海細(xì)胞生物研究所，保存于福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 八寶丹（麝香、羚羊角、牛黃、蛇膽、三七、珍珠）購自廈門中藥廠股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素、鏈霉素）、0.25%胰蛋白酶、二甲亞砜（DMSO）均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）干粉購自北京索萊寶科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone公司；Hoechst 33258染色試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱、－80℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica儀器有限公司）；形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)LAS V4.1、Countes?全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國 Life公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 BBD溶液的制備 將八寶丹粉末用PBS配制成 25 mg／mL的藥液，超聲溶解、高壓滅菌后于4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌細(xì)胞株AGS、MGC-803置于含 10%滅活 FBS、100 U／mL 青霉素和 100 μg／mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長，當(dāng)匯合度至80%～90%時(shí)，加入1 mL胰蛋白酶（含0.25%EDTA）消化后，加入2 mL完全培養(yǎng)基中和以終止消化，1000 r／min離心3 min，棄上清液，收集沉淀細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸制成新細(xì)胞懸液后傳代。

2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的AGS和MGC-803胃癌細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×105個(gè)／mL，每孔 100 μL，置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，棄掉原培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度BBD（終濃度分別為 0、0.25、0.5、0.75、1 mg／mL）的培養(yǎng)基，每孔 100 μL，分別干預(yù) 24 h和 48 h后吸棄各孔溶液，每孔加入 0.5 mg／mL的MTT溶液100 μL，37℃孵育4 h后吸棄各孔中的液體，加入DMSO 100 μL／孔，室溫靜置 10 min，充分振蕩混勻，使結(jié)晶充分溶解并混勻，采用全自動酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定各組吸光度值（A值），并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

細(xì)胞生長抑制率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組A值／對照組A值）×100%。

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察與計(jì)數(shù) 取對數(shù)生長期的AGS和MGC-803細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)／孔，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，用不同濃度 BBD（0、0.25、0.5、0.75、1 mg／mL）干預(yù) 24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。拍照后細(xì)胞予消化、中和、離心、重懸處理，臺盼藍(lán)染色，于Countes?全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對AGS和MGC-803細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

2.5 集落形成實(shí)驗(yàn) AGS和MGC-803細(xì)胞以2.5×105個(gè)／孔接種于6孔板，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，加入不同濃度 BBD（0、0.25、0.5、0.75、1 mg／mL）干預(yù) 24 h。吸棄培養(yǎng)液，用PBS清洗，經(jīng)過消化、中和、離心、重懸操作，將細(xì)胞按500個(gè)／孔接種于12孔板中，2～3 d換液，且換液前于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，連續(xù)培養(yǎng)7～10 d后，當(dāng)培養(yǎng)板孔中出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)，停止培養(yǎng)。吸棄上清，用PBS清洗2～3次。加入4%多聚甲醛固定10 min，吸棄4%多聚甲醛后用PBS清洗2～3遍，最后每孔用結(jié)晶紫染色液染色20 min，吸棄染色液，用高壓過的純水清洗3遍，相機(jī)拍照觀察集落形成情況。

2.6 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡 AGS和MGC-803細(xì)胞以1.5×105個(gè)／孔接種于12孔板，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，加入不同濃度 BBD（0、0.25、0.5、1 mg／mL）干預(yù)24 h。用4%多聚甲醛室溫固定10 min，然后吸棄，每孔加入200 μL分裝好的hoechst 33258工作液染色，4℃避光反應(yīng)15 min，用PBS沖洗細(xì)胞3次，最后一次留在孔中。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況并拍照（×200）。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 不同濃度BBD干預(yù)后AGS、MGC-803抑制情況比較 MTT檢測結(jié)果顯示不同濃度的BBD可顯著抑制胃癌細(xì)胞AGS和MGC-803的增殖，具有明顯的劑量依賴和時(shí)間依賴作用。見表1、表2。

表1 不同濃度BBD干預(yù)后AGS、MGC-803抑制率比較（n＝8，）

表1 不同濃度BBD干預(yù)后AGS、MGC-803抑制率比較（n＝8，）

注：與對照組比較，1） P＜0.01。

組別對照組實(shí)驗(yàn)組BBD 濃度（mg／mL）0 0.25 0.50 0.75 1 AGS抑制率／% MGC-803抑制率／%24 h 0±2.82 7.83±2.331）18.46±5.411）38.95±3.731）68.70±3.531）48 h 0±1.74 27.49±5.701）33.61±6.631）63.16±4.461）88.99±1.671）24 h 0±2.19 6.41±4.261）7.16±4.051）13.43±3.281）41.49±3.421）48 h 0±3.34 22.59±4.321）30.82±3.301）41.56±4.481）53.82±4.851）

表2 不同濃度BBD干預(yù)后AGS、MGC-803細(xì)胞數(shù)比較（n＝8，）

表2 不同濃度BBD干預(yù)后AGS、MGC-803細(xì)胞數(shù)比較（n＝8，）

注：與對照組比較，1） P＜0.01。

組別對照組實(shí)驗(yàn)組BBD濃度（mg／mL）0 0.25 0.50 0.75 1 AGS／×105個(gè)9.59±0.47 8.75±0.381）6.76±0.351）6.35±0.521）0.51±0.041）MGC-803／×105個(gè)18.60±0.66 9.24±0.621）8.24±0.581）7.29±0.611）6.19±0.291）

3.2 BBD對細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞AGS和MGC-803經(jīng)不同濃度的BBD干預(yù)24 h后，隨著藥物濃度的增加，AGS和MGC-803細(xì)胞密度逐漸減少，懸浮細(xì)胞增多，部分細(xì)胞皺縮變圓。見圖1。

3.3 BBD對細(xì)胞集落形成能力的影響 集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BBD對胃癌細(xì)胞AGS、MGC-803的集落形成能力有明顯的抑制作用，具有一定的劑量依賴性。見圖2。

3.4 BBD對細(xì)胞凋亡的影響 Hoechst 33258染色結(jié)果顯示BBD具有誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞AGS、MGC-803凋亡的作用，凋亡細(xì)胞數(shù)隨著BBD濃度增加而逐漸增多，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴作用。見圖3。

4 討 論

中醫(yī)理論認(rèn)為腫瘤形成多由于氣滯血瘀，或熱毒內(nèi)蘊(yùn)，或痰凝濕聚，或正氣虧虛、久之瘀積邪毒而致。腫瘤的化療藥物多為細(xì)胞毒性藥物，大多具有嚴(yán)重不良反應(yīng)，直接影響腫瘤的療效，因此從天然藥物中尋找具有抗腫瘤活性且不良反應(yīng)較小的成分是腫瘤治療的研究方向之一。研究證實(shí)中醫(yī)藥具有抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、調(diào)節(jié)免疫、抑制血管新生、抑制端粒酶的表達(dá)、抗侵襲轉(zhuǎn)移及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等方面的作用［4］。BBD以天然牛黃、珍珠、蛇膽、三七、麝香、羚羊角等八味名貴中藥精制而成，諸藥合用共奏清熱解毒、活血化瘀之效，符合中醫(yī)辨證抗腫瘤的機(jī)理，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明麝香、牛黃、三七等均有明顯抗腫瘤療效［5-7］。在本研究中，MTT結(jié)果顯示，BBD對胃癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈一定的時(shí)間和濃度依賴性。

近年來，隨著人們對腫瘤研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅與腫瘤細(xì)胞增殖過度和分化異常有關(guān)，而且與細(xì)胞凋亡受阻密切相關(guān)［8］。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)是研究腫瘤細(xì)胞存活和細(xì)胞增殖能力最常用的方法之一，且結(jié)果呈現(xiàn)直觀。集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示BBD對胃癌細(xì)胞AGS和MGC-803的集落形成能力具有明顯的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)BBD具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用。

圖1 不同濃度BBD干預(yù)24 h AGS、MGC-803細(xì)胞形態(tài)圖（×200）

圖2 不同濃度BBD干預(yù)AGS、MGC-803細(xì)胞集落形成染色圖

圖3 不同濃度BBD干預(yù)AGS、MGC-803細(xì)胞Hoechst染色圖（×200）

細(xì)胞凋亡是一種程序化的細(xì)胞死亡過程，典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變包括細(xì)胞膜出泡、細(xì)胞皺縮、核染色質(zhì)固縮和凋亡小體形成［9］。Hoechst染色是一種經(jīng)典而又快速的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法［10］。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，與鄰周細(xì)胞脫離，胞漿聚縮，核染色體密度增高呈半月形，且在核膜周邊凝集，核仁發(fā)生裂解，細(xì)胞內(nèi)陷，進(jìn)而形成凋亡小體。本實(shí)驗(yàn)中，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，BBD能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞AGS和MGC-803的凋亡，且呈劑量依賴性。

綜上所述，本研究結(jié)果提示BBD抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其治療胃癌的重要作用機(jī)制。但BBD治療胃癌等惡性腫瘤的作用機(jī)制研究尚不深入及不系統(tǒng)，亟待進(jìn)一步的研究探索。

［1］ VAN CUTSEM E，SAGAERT X，TOPAL B，et al.Gastric cancer ［J］.Lancet，2016，388（10060）：2654-2664.

［2］ MCLEAN M H，EL-OMAR E M.Genetics of gastric cancer ［J］.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2014，11（11）：664-674.

［3］ 耿冬梅，張良明，隋銘驊.八寶丹膠囊輔助晚期腫瘤化療的研究［J］.山西醫(yī)藥雜志，2010，39（6）：562-564.

［4］ 王亞坤，謝長生，樓金杰，等.中醫(yī)藥治療胃癌的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（11）：2743-2745.

［5］ 孟照華，單禮成，曾家修，等.皮下埋藏麝香對BALB／c純系小鼠惡性腫瘤生長影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國腫瘤臨床，1998，25（11）：834-836.

［6］ 武凡，張樹三，康格非.三七皂甙對肝纖維化大鼠分泌型磷脂A2和腫瘤壞死因子表達(dá)的影響［J］.中華肝臟病雜志，2003，11（1）：51-52.

［7］ 李蒙，于建勛.單味中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究現(xiàn)狀及展望［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，21（1）：74-76.

［8］ WUCHTER C，KARAWAJEW L，RUPPERT V，et al.Constitutive expression levels of CD95 and Bcl-2 as well as CD95 function and spontaneous apoptosis in vitro do not predict the response to induction chemotherapy and relapse rate in childhood acute lymphoblastic leukaemia ［J］.Br J Haematol，2000，100（1）：154-160.

［9］ 孫沛林，金京春，王瑩，等.黃芩素誘導(dǎo)胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡［J］.腫瘤，2017，37（10）：1041-1046.

［10］朱彩平，張聲華，肖軍霞.枸杞多糖誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（19）：329-334.