低溫脅迫對煙苗葉形及生理特性的影響

李琦瑤，王樹聲，周培祿，劉光亮，曾文龍，周道金，鄭 璇，陳愛國*

煙草移栽后因倒春寒帶來的低溫冷害問題在我國南方煙區普遍存在。低溫致使煙苗生長緩慢或受阻，造成煙葉產量和品質下降[1]。前人研究表明，煙草生長的最適溫度為25～28 ℃，1～2 ℃低溫可使幼苗死亡[2]。煙草需達到一定苗齡才能具備感受低溫的能力，從而引起相關生理響應。韓錦峰等[3]通過低溫誘導頂芽發育及激素含量發現，煙草 K326在6片真葉之前對低溫不敏感，7葉期才是煙草感受低溫最敏感的時期。當前，低溫對煙草生長發育的影響以早花為主[4]，而針對我國南方煙區出現的因低溫冷害帶來的上部葉開片差問題的研究卻未見報道。葉形變化是由量變到質變逐漸發展的過程，低溫脅迫時間越長，葉形受到的抑制作用越明顯[5]。研究證實，低溫對其影響主要體現在葉片基-頂軸和中-側軸兩個軸向生長共同決定的葉片長寬比上[6]。

本試驗選用對低溫敏感且在我國廣泛種植的烤煙品種K326為材料[7-8]，利用人工智能氣候箱對煙草苗期進行低溫脅迫處理，通過對相關生理指標的測定，探討低溫脅迫后的生理特性與恢復生長后葉片長寬比的關系，為揭示低溫脅迫下煙苗葉形變化的生理機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017年1—8月在中國農業科學院煙草研究所即墨農場進行。供試品種烤煙K326由國家農作物種質資源平臺煙草種質資源子平臺（中國農業科學院煙草研究所）提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 將25 ℃下長至7葉齡的煙苗置于人工智能氣候箱內進行4 ℃低溫脅迫處理。前期預試驗證明，4 ℃低溫脅迫48 h后常溫下難以恢復生長，故確定該脅迫溫度的臨界時長為48 h。以常溫（25 ℃）生長的煙苗為對照，設置低溫（4 ℃）脅迫3、6、12、24和48 h為處理，處理后分別置于25 ℃下恢復生長。

1.2.2 生理指標測定 低溫脅迫結束時，每個處理設置3次重復，每個重復選取3株煙苗的自下而上第4葉位葉片，混合，進行相關生理指標測定。測定方法如下：

電導率的測定采用真空抽氣法；丙二醛（MDA）含量的測定采用2-硫代巴比妥酸顯色法；可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法；脯氨酸含量的測定采用磺基水楊酸提取法；葉綠素含量的測定采用80%丙酮提取液浸提法；超氧物歧化酶（SOD）活性的測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法；過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創木酚比色法；過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用比色法。以上方法參照文獻[9]。

1.2.3 低溫后恢復生長煙苗葉形測量 選擇常溫對照、低溫脅迫3、6、12、24和48 h后恢復生長的煙苗，每隔2天用卷尺人工測量自下而上第4葉位葉片的葉長、葉寬，計算長寬比（葉長/葉寬），每處理重復測量 3株。測量方法參考 YC/T 142—2010煙草農藝性狀調查測量方法。

1.2.4 數據分析 利用Microsoft Excel 2007和SAS 9.4對數據進行處理、統計分析及圖形制作。

2 結 果

2.1 不同低溫脅迫時間對煙苗生理特性的影響

2.1.1 不同低溫脅迫時間對煙苗細胞膜系統的影響 圖1-A示出，常溫生長的煙苗48 h內電導率變化不大，而低溫生長的煙苗相對電導率隨脅迫時間的增加不斷升高。低溫脅迫3、6、12、24、48 h較脅迫前分別增加 39.7%、51.3%、83.1%、87.0%、112.1%，均達顯著性差異水平（p＜0.05）。圖1-B示出，常溫生長的煙苗48 h內MDA含量變化不大，而低溫生長的煙苗MDA含量隨低溫脅迫時間的增加先升高后降低。低溫脅迫3、6、12、24、48 h較脅迫前分別增加 80.5%、136.3%、67.6%、67.2%、31.7%。

2.1.2 不同低溫脅迫時間對煙苗保護酶系統的影響 圖2-A所示，常溫和低溫生長的煙苗48 h內SOD活性變化不大。除低溫脅迫12 h外，低溫脅迫3、6、24、48 h較脅迫前分別增加18.2%、16.8%、28.7%、28.4%。圖2-B所示，常溫和低溫生長的煙苗48 h內POD活性變化也不明顯。低溫脅迫3、6 h較脅迫前分別降低13.2%、2.6%；低溫脅迫12、24 h分別增加13.1%、3.6%；低溫脅迫48 h降低11.6 %。圖2-C所示，常溫生長的煙苗48 h內CAT活性變化不大，而低溫生長的煙苗CAT活性隨脅迫時間的增加不斷降低。低溫脅迫3、6、12、24、48 h較脅迫前分別降低23.3 %、35.2 %、38.4 %、35.4 %、54.1%，均達顯著性差異水平（p＜0.05）。

圖1 低溫脅迫對煙草苗期相對電導率和丙二醛含量的影響Fig. 1 Effect of low temperature stress on relative conductivity and the content of malonaldehyde in tobacco seedlings

圖2 低溫脅迫對煙草苗期SOD、POD和CAT活性的影響Fig. 2 Effect of low temperature stress on SOD activity, POD activity and CAT activity in tobacco seedlings

2.1.3 不同低溫脅迫時間對煙苗滲透調節物質的影響 圖3-A所示，常溫生長的煙苗48 h內脯氨酸含量變化不大，而低溫生長的煙苗隨脅迫時間的增加不斷升高。低溫脅迫3、6、12、24、48 h較脅迫前分別增加 53.5%、101.1%、223.7%、254.5%、320.0 %，均達顯著性差異水平（p＜0.05）。圖 3-B所示，常溫生長的煙苗48 h內可溶性糖含量變化不大，而低溫生長的煙苗隨脅迫時間的增加不斷升高。低溫脅迫 3、6、12、24、48 h較脅迫前分別增加118.0%、220.4%、286.7%、421.7%、436.1%，均達顯著水平（p＜0.05）。

2.1.4 不同低溫脅迫時間對煙苗葉綠素含量的影響 圖4示出，常溫生長的煙苗48 h內葉綠素含量變化不大，而低溫生長的煙苗隨脅迫時間的增加先升高后降低。低溫脅迫3、6、12、24、48 h較脅迫前分別增加15.9%、20.5 %、39.4%、65.2%、37.9%，均達顯著性差異水平（p＜0.05）。除脅迫前，同一時間不同溫度條件下的葉綠素含量也均達顯著性差異水平（p＜0.05）。

圖3 低溫脅迫對煙草苗期脯氨酸和可溶性糖含量的影響Fig. 3 Effects of low temperature stress on the content of proline and the content of soluble sugar in tobacco seedlings

圖4 低溫脅迫對煙草苗期葉綠素含量的影響Fig. 4 Effects of low temperature stress on the content of chlorophyll in tobacco seedlings

2.2 不同低溫脅迫時間對煙苗葉形指標的影響

由表1可知，低溫處理前各處理煙苗葉形指標大致相同。低溫脅迫48 h內煙苗均能恢復生長，但不同低溫脅迫時間處理后煙苗葉長、葉寬和葉面積的生長速度及葉片長寬比的變化趨勢較同期對照有所差異。低溫脅迫后恢復生長第 16天，所有處理的煙苗葉片長寬比趨于穩定。進一步對恢復生長20 d后葉形指標進行方差分析發現，不同低溫脅迫時間處理的煙苗葉長較同期對照無明顯差異，但葉寬、葉面積均顯著小于同期對照，說明4 ℃低溫脅迫3 h即可對恢復生長后的葉面積造成不可逆的影響。葉片長寬比方面，常溫生長的煙苗葉片長寬比未發生明顯變化，維持在1.764～1.787，而低溫處理后的煙苗均表現出長寬比增大趨勢，整體來看，低溫脅迫時間對葉片長寬比的影響程度為12 h＞24 h＞6 h＞3 h＞48 h，其中低溫脅迫12 h顯著大于同期對照（p＜0.05）。低溫脅迫3 h后葉片長寬比峰值出現在恢復生長后第10天，而低溫脅迫6、12、24和48 h的峰值均在第16天。

3 討 論

植物對低溫脅迫的響應是一種積極主動的應激過程[10-11]。大量研究表明[12-14]，細胞膜的損傷與自由基、活性氧引起的膜脂過氧化和蛋白質活性降低甚至喪失有關[15]。本試驗中，不同低溫脅迫時間處理的煙苗相對電導率和MDA含量均顯著高于同期對照，其中MDA含量在低溫脅迫12 h后開始降低，其原因可能是煙苗在經歷一定時間的冷馴化后，細胞內不飽和脂肪酸和磷脂含量有所增加，細胞膜的流動性增強，抗寒性得到提高[16-17]。SOD、POD和 CAT等抗氧化酶能清除體內活性氧，是植物應對逆境脅迫的天然保護體系[18]。本試驗中，不同低溫脅迫時間處理后SOD和POD活性變化不大。前人研究發現，POD在酶促保護系統中具有雙重性，可能參與活性氧的生成和葉綠素的降解，并可能引發膜脂過氧化作用，表現出一定的傷害效應[19]。此外，低溫影響NADP+的供給過程，電子傳遞失衡導致活性氧含量增加也會影響SOD和POD的活性[20]。另有報道稱，生長素的生物合成直接參與葉片形態決定[21]。研究發現[22]，擬南芥CAT2突變體中，生長素的含量受到過氧化氫的調控，并且由過氧化氫調節導致的生長素含量的降低是與植物偏下性生長的葉片表型相連鎖的。本研究中，CAT活性隨低溫脅迫時間的增加不斷降低，與楊雪梅等[23]測定結果并不一致，其原因有待進一步研究。

表1 低溫后恢復生長階段煙苗的葉形變化Table 1 Change of leaf shape of tobacco seedlings in low temperature after resuming growth

低溫脅迫會使植物細胞內主動積累大量統稱為滲透溶質的小分子代謝物質，包括氨基酸、糖以及季銨類化合物（如甜菜堿等）等，其含量的增加有助于細胞持水和生物大分子結構的穩定[24]。本試驗中，不同低溫脅迫處理的煙苗脯氨酸和可溶性糖含量均顯著高于同期對照，且均在低溫脅迫12 h時出現大幅增加，說明煙草K326在低溫脅迫12 h其耐冷性與脯氨酸和可溶性糖的積累有一定的相關性[25]。低溫會打破葉綠素原有的合成和降解平衡，從而導致葉綠素含量發生變化[26]。隨低溫脅迫時間的延長，葉綠素含量先升高后降低，一方面可能是脅迫后期葉綠素合成酶活性降低，葉綠體合成受阻而造成，另一方面也可能是低溫引起了葉綠體功能的紊亂[27]，或加速了葉綠素的分解和葉綠體形態結構的受損使葉綠素含量降低[28]，同樣的研究結論在不同楊樹耐冷的生理研究中也得到驗證[29]。

我國南方煙區因早春低溫冷害帶來的早花、上部葉開片差等問題嚴重影響煙葉的產量和品質[30]。本試驗中，4 ℃低溫脅迫顯著抑制葉長和葉寬的生長，且對葉寬的抑制作用強于對葉長的抑制作用，說明4 ℃低溫脅迫對葉片中-側軸的影響高于基-頂軸，葉寬生長停滯的響應要早于葉長，從而增大葉片長寬比，這與前人研究夜間低溫對紅花大金元、云煙87葉形的影響研究結果一致[7]。恢復生長16 d后，不同處理的葉片長寬比均達最高峰，此后趨于穩定。分析恢復生長20 d后各葉形指標發現，低溫脅迫3 h處理就對恢復生長后的煙苗葉面積造成不可逆的影響，且恢復生長20 d后不同低溫脅迫時間處理煙苗的葉面積無明顯差異，而此時低溫脅迫12 h處理的煙苗葉片長寬比顯著大于同期對照及其他低溫處理葉片長寬比，進一步說明12 h的低溫脅迫對葉片橫向生長影響程度較大。

表1 （續）Table 1 （Continued）

對于溫敏性較強的品種K326，在受到4 ℃低溫脅迫生長時，應在低溫時間48 h內采取措施，避免葉形狹長及葉片生長延緩甚至停滯的現象。前人研究發現[7]，低溫對烤煙 K326苗期葉長葉寬生長存在累加效應，夜間低溫處理時間越長累加效應越明顯，煙葉長寬生長停滯累加效應葉寬效果要明顯于葉長。本試驗中，不同低溫脅迫時間對葉片長寬比增大的誘導程度為12 h＞24 h＞6 h＞3 h＞48 h，低溫脅迫12～24 h對葉形影響最大，但脅迫48 h后影響效果又有所減小，原因有待進一步研究。此外，本研究選取的烤煙生長階段為苗期，脅迫溫度為4 ℃，具有生長階段針對性和溫度局限性，其他脅迫溫度或苗期以外的生長時期能否得出相同的結論還有待進一步試驗和探索。

4 結 論

隨著低溫脅迫時間的增加，相對電導率、脯氨酸含量和可溶性糖含量不斷升高；MDA含量和葉綠素含量先升高后降低；CAT活性不斷降低；SOD和 POD活性變化不大。4 ℃低溫脅迫抑制恢復生長后葉片葉長、葉寬和葉面積的生長，對葉寬的抑制作用強于對葉長的抑制作用，葉片長寬比增大。不同低溫脅迫時間對葉片長寬比增大的誘導程度為 12 h＞24 h＞6 h＞3 h＞48 h。

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