采后煙葉碳代謝的動態變化分析

蔣博文，王 濤，宋朝鵬，王松峰，高華鋒，解 燕，毛建書，賀 帆*

碳水化合物及糖類代謝是植物最基本的初生代謝，直接影響著植物的基本生命活動[1-2]。淀粉是煙葉中碳水化合物貯藏的主要形式，成熟鮮煙葉中的淀粉含量可達40%[3]。烤后煙葉中殘留的淀粉嚴重影響煙葉質量，而由淀粉降解產生的還原糖既可以增加煙葉香吃味，又可以參與調節煙氣酸堿平衡[4]，因此采后煙葉淀粉和糖代謝對煙葉質量有重要影響。成熟煙葉采收至烘烤定色前，煙葉處于饑餓代謝狀態，其內部進行著復雜的生理生化變化，研究采后煙葉內碳代謝的變化規律對提高煙葉的烘烤品質具有重要意義。

張松濤等[5]研究發現，云南煙葉成熟過程中焦磷酸化酶基因NtAGPase和顆粒結合型淀粉合成酶基因NtGBSS1表達量明顯強于河南煙葉，推測淀粉組分之間的差異可能是造成云南烤后煙葉淀粉含量顯著低于河南的原因。張嘉煒等[6]、賈宏昉等[7]研究發現，土壤中添加腐熟秸稈、生物碳等，淀粉代謝相關基因NtAGPase、NtGBSS1和蔗糖代謝相關基因NtSuS等表達增強，從而促進成熟期煙葉碳代謝的進行，有利于提高煙葉的品質。楊勝男等[8]研究發現，復合有機肥可促進葉片細胞中淀粉的積累，并改變淀粉組分，其中NtGBSS1的表達隨復合有機肥施用量的增加而減弱，可溶性淀粉合成酶基因NtSS的表達隨復合有機肥施用量增加而增強。王紅麗等[9]研究發現，糖代謝相關基因NtINV、NtSuS、NtSPS表達量隨生育期的推進而逐漸增強，淀粉代謝相關基因NtGBSS1表達量不受煙葉成熟時期的影響。

煙葉離體至烘烤定色前仍然進行著劇烈的生理生化反應[10]，但目前關于碳代謝的研究集中在煙草大田成熟期，且涉及的碳代謝基因較片面，對于采后離體煙葉內淀粉和糖代謝的變化規律研究鮮有報道。本研究以豫煙12號和秦煙96為材料，在生態環境、土壤肥力、栽培措施等一致前提下，測定采后不同時段煙葉中淀粉、總糖和還原糖含量變化，利用實時熒光定量PCR技術檢測采后煙葉淀粉和糖代謝相關基因的表達規律，為分子調控煙葉碳代謝，合理調控烘烤工藝提供理論依據，并為進一步研究烘烤過程中煙葉碳代謝規律奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自河南省洛陽市洛寧縣煙草科技示范基地，供試品種為豫煙12號和秦煙96。試驗田地處東經 111°38′，北緯 34°26′，年平均氣溫13.7 ℃，日照時數2217.6 h，無霜期216 d，常年降水量600～800 mm。植煙土壤為黃棕壤，肥力中等，pH 7.17，有機質 12.10 g/kg，堿解氮71.74 mg/kg，速效磷9.32 mg/kg，速效鉀170.59 mg/kg，試驗田地勢平坦，灌排方便，在該煙區代表性強。按照當地施氮量施肥，磷、鉀肥施用量保持一致，其余田間管理措施同當地優質煙葉生產技術規范。

1.2 試驗設計

2016年8月15日采摘成熟度一致的無病蟲害的適熟中部葉（10～12葉位），置于溫度為 30 ℃，相對濕度為90%恒溫恒濕的暗箱（暗箱提前用0.1%的 DEPC水處理）中。適熟煙葉成熟特征統一為：移栽后 80 d，葉面落黃八成左右，主脈全白發亮，支脈變白，葉尖、葉緣下卷，葉面起皺[11]。于采后0、6、12、18、24和30 h分別進行取樣，每次隨機選取 10片煙葉進行淀粉、糖含量和基因表達量的測定，重復3次取樣。

1.3 糖和淀粉含量測定

將各個時段所取的煙葉葉尖和葉基部各剪去10 cm，去主支脈，先用烘箱在105 ℃下殺青15 min，再降至65 ℃烘干，研磨，并經60目過濾篩過濾保存。總糖、還原糖采用 AAⅢ型連續流動化學分析儀（德國BRAN+LUEBBE公司生產）測定，淀粉采用高氯酸超聲萃取-連續流動法測定[12]。試驗重復3次。

1.4 基因表達量分析

各個時段分別取5片煙葉，去主支脈后混合以減少試驗誤差，所取葉片用紗布和錫箔紙包裹，迅速置于液氮中冷凍，于-80 ℃超低溫冰箱保存。采用Trizol法提取煙葉總RNA，通過隨機引物法反轉錄合成cDNA[13]。根據GenBank發布的碳代謝基因的序列設計PCR引物（表1），進行實時定量PCR檢測。以煙草核糖體蛋白編碼基因NtL25作為內參基因，引物由蘇州金唯智生物科技公司合成。按照Invitrogen公司的RealMasterMix (SYBR Green)試劑盒說明書進行實時定量RT-PCR，每個樣品3次重復。實時定量的實驗結果采用 2-ΔΔCt算法[14]進行分析。植物細胞內淀粉和糖的代謝是一個有機循環過程，葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉之間通過各種酶相互轉化，論文中涉及的淀粉和糖代謝基因所處的碳代謝位置見圖1[15-28]。

表1 糖和淀粉代謝相關基因的實時定量PCR引物序列Table 1 Primers for qPCR of sugar and starch metabolism related genes in tobacco

1.5 數據統計分析

用Microsoft Excel 2010進行數據處理和繪圖。用SPSS 20統計軟件進行數據分析，用Pearson相關系數進行相關分析。

2 結 果

2.1 采后煙葉淀粉和糖含量變化

如圖2所示，秦煙96鮮煙葉（采后0 h）淀粉和總糖含量均顯著高于豫煙12號，其中秦煙96鮮煙葉淀粉含量為 30.56%，極顯著高于豫煙 12號（25.49%），總糖含量為4.83%，顯著高于豫煙12號（3.86%）；隨著采收時間的推移，煙葉內淀粉含量呈下降趨勢，而總糖和還原糖含量呈上升趨勢，其中糖含量在采后12 h后增加速率變快；采后30 h，豫煙12號淀粉含量較0 h降解19.22%，而秦煙96降解23.89%，秦煙96淀粉降解率顯著大于豫煙12號，但總糖和還原糖的增長率（3.38%、4.12%）卻小于豫煙12號（4.30%、5.04%）。

2.2 采后煙葉淀粉代謝相關基因的表達量變化

圖1 植物碳代謝途徑Fig. 1 Carbon metabolism pathways in plants

圖2 采后煙葉淀粉和糖含量的變化Fig. 2 Changes of starch and sugar contents in tobacco leaves after harvest

表2 采后煙葉淀粉代謝相關酶基因的相對表達量變化Table 2 Changes of relative expression levels of starch metabolism related genes in tobacco leaves after harvest

由淀粉合成起始步驟的關鍵酶AGPase的基因表達分析發現（表2），豫煙12號和秦煙96成熟和采后煙葉中NtAGPL3和NtAGPS2無表達；NtAGPS1和NtAGPS3在秦煙96成熟煙葉（0 h）中的表達量均高于豫煙12號；NtAGPS1表達量在采收后的30 h內逐漸下降，而NtAGPS3表達量在采后6 h迅速下調至較低水平。NtAGPS1基因的變化趨勢與總淀粉含量變化相似，可能是淀粉合成起始步驟的關鍵基因。

秦煙96鮮煙葉（0 h）中直鏈淀粉合成的關鍵酶基因NtGBSS1表達量高于豫煙12號。在采后30 h內，NtGBSS1表達量逐漸下降，其整體變化趨勢與總淀粉變化相似，可能是淀粉合成的關鍵基因。

可溶性淀粉合成酶基因在兩個品種中的表達量變化趨勢不同：NtSS1的表達量在煙葉采收后6 h降至低谷，隨后略有增加，采后30 h時，秦煙96的表達量高于豫煙12號；NtSS2在秦煙96中的表達量變化與NtSS1相似，而NtSS2在豫煙12號中呈逐漸下降趨勢。

淀粉分支酶基因表達量變化趨勢在兩個品種中不同：秦煙96成熟煙葉（0 h）中NtSBE1和NtSBE2的表達量均高于豫煙12號；秦煙96中的NtSBE1的表達量在煙葉采收后6 h降至低谷，隨后逐漸增加；豫煙12號中的NtSBE1的表達量在煙葉成熟至采收后12 h均維持在較低水平，隨后逐漸增加并在采后18 h達到高峰，而后降低至采后6 h的表達量水平；NtSBE2在秦煙96中的表達趨勢與NtSS1和NtSS2相似，而在豫煙12號中呈逐漸下降趨勢。可見，不同淀粉分支酶在不同品種中的表達特性不同。

淀粉去分支酶基因表達量變化研究發現，煙葉成熟時，NtISO1在豫煙12號中的表達量高于秦煙96；隨后其在兩個品種中均呈先增再降的變化趨勢，在采收后30 h，秦煙96中NtISO1表達量高于豫煙12號。NtISO2、NtISO3和NtSR1基因在秦煙96煙葉成熟期的表達量高于豫煙 12號，煙葉采收后，秦煙96中NtISO2、NtISO3和NtSR1基因表達量呈“U”型變化，而豫煙12號中這些基因的表達量整體無劇烈變化。

淀粉水解酶基因Ntα-amylase和Ntβ-amylase的表達模式顯示，煙葉成熟時，豫煙 12號的淀粉水解酶基因表達量高于秦煙96；煙葉采收后兩個品種中Ntα-amylase和Ntβ-amylase表達量整體呈上調趨勢；采后30 h，秦煙96中淀粉水解酶基因表達量高于豫煙12。

淀粉磷酸化酶基因NtSP表達量變化研究發現，煙葉成熟時，秦煙96的NtSP表達量遠高于豫煙12號；煙葉采后6 h，兩品種中NtSP表達量均迅速降低，煙葉采收30 h時，秦煙96的NtSP表達量高于豫煙12號。

2.3 采后煙葉糖代謝相關酶基因的表達量變化

如表3所示，檢測采后煙葉蔗糖磷酸合成酶基因（NtSPSA、NtSPSB、NtSPSC）的表達量發現，這些基因在兩個品種中的表達量差異較大，煙葉成熟及采后30 h，秦煙96中NtSPS的表達量遠高于豫煙12號；豫煙12號NtSPSA、NtSPSB和NtSPSC的表達量均呈先升高后降低趨勢；秦煙 96三個基因表達量在采后6 h迅速下調至較低水平，但隨后呈上調趨勢，30 h時又迅速降低，其中NtSPSA表達量在采后30 h時仍處于較高水平。

蔗糖磷酸合成酶和蔗糖磷酸酶常以復合體的形式存在于植物體內。秦煙 96成熟煙葉和采收后煙葉中NtSPP1和NtSPP2表達量整體高于豫煙12號；秦煙96成熟煙葉（0 h）中NtSPP1和NtSPP2表達量較高，采后6 h表達量迅速下降，隨后呈上調趨勢。

表3 采后煙葉糖代謝相關酶基因的相對表達量變化Table 3 Changes of relative expression levels of sucrose metabolism related genes in tobacco leaves after harvest

煙葉成熟時及采后30 h，秦煙96中蔗糖合成酶基因NtSuS和糖酵解關鍵基因NtVIN1的表達量遠高于豫煙12號；豫煙12號NtSuS和NtVIN1表達量呈先上升后下調趨勢；秦煙 96中NtSuS和NtVIN1表達量在采后6 h迅速下降至較低水平，隨后呈逐漸上調趨勢。

2.4 采后煙葉淀粉、糖含量變化與酶基因表達量變化的相關性

由表 4看出，淀粉合成代謝關鍵酶基因NtAGPS1表達量變化與兩品種煙葉中淀粉和糖含量呈顯著相關性，且與豫煙 12號淀粉含量變化相關性達極顯著水平（r=0.987，p＜0.01）；NtGBSS1表達量變化與豫煙 12號采后煙葉淀粉含量變化呈顯著正相關（r=0.876，p＜0.05），與其余碳水化合物變化相關性較強（r=-0.776、-0.785、0.709、-0.671、-0.696）；NtAGPS3、NtSS2、NtSBE2、NtSR1和Ntβ-amylase雖然與豫煙12號和秦煙96某一生理指標相關性顯著，但與其余碳水化合物相關性較弱。總體來說，采后煙葉中碳水化合物變化與淀粉代謝相關酶基因表達量變化相關性較強，與糖代謝相關酶基因表達量變化相關性較弱，即采后煙葉碳代謝由淀粉代謝相關酶基因起關鍵調控作用。

表4 采后煙葉淀粉、糖含量和代謝相關酶基因表達量的相關性Table 4 Correlation between starch, sugar contents and metabolic related gene expression

3 討 論

煙葉烘烤過程中碳水化合物含量變化顯著，淀粉在淀粉酶的作用下大量分解，同時糖類在相關酶的作用下進行呼吸消耗，但淀粉產生的糖量大大超過呼吸消耗的糖量，因此，采后離體煙葉淀粉含量逐漸下降，而糖含量逐漸增加[29-30]。本研究中豫煙12號和秦煙96生態條件、栽培措施和生育期一致，但成熟期煙葉中營養物質差異較大，秦煙 96鮮煙淀粉含量極顯著高于豫煙 12號，這可能與烤煙品種本身的基因表達量關系密切；采后30 h時，秦煙96淀粉降解率大于豫煙12號，而糖含量增加率卻低于豫煙12號，一定程度上說明秦煙96采后煙葉呼吸代謝旺盛，消耗糖較多，即秦煙 96烘烤過程中煙葉碳水化合物降解轉化較豫煙12號充分。

碳代謝是煙株生長發育、產量和品質形成過程中最基本的代謝過程，煙葉碳代謝既受煙株本身遺傳基因的支配，又受環境條件和栽培技術的影響，是一種多基因系統與環境因素交互作用的結果[31]。從豫煙12號和秦煙96鮮煙葉（0 h）中淀粉和糖代謝相關酶基因的表達量的差異對比可以看出，秦煙96鮮煙葉中淀粉和糖代謝的相關酶基因NtAGPS3、NtGBSS1、NtSS1、NtSS2、NtSBE1、NtSBE2、NtISO2、NtISO3、NtSP、NtSPSA、NtSPSB、NtSPSC、NtSPP1、NtSPP2、NtSuS和NtVIN1的表達量均顯著高于豫煙12號，而淀粉分解的關鍵酶基因Ntα-amylase和Ntβ-amylase表達量卻顯著低于豫煙12號，說明同一生態環境和栽培措施條件下，秦煙 96成熟期淀粉合成代謝和糖代謝較豫煙12號強，因此秦煙96鮮煙葉中淀粉含量顯著高于豫煙 12號。這與品種自身的遺產特性和適應性有關。有研究表明，豫煙12號不耐肥，在高氮條件下碳代謝弱，氮代謝強，成熟特性較差，難落黃[32]；而秦煙 96則是一個能夠兼顧品質、抗性、產量、適應性等方面的優良品種[33]。

AGPase是淀粉合成的限速酶，該酶活性的大小直接決定淀粉合成的速率和最終合成量多少[15]；顆粒結合型淀粉合成酶GBSS主要參與直鏈淀粉的合成，是植物中研究最多的一類淀粉合成酶[16]。本研究發現，豫煙12號和秦煙96淀粉合成的關鍵酶基因為NtAGPS1，NtAGPS1在采后煙葉中呈逐漸下調趨勢，且與采后煙葉淀粉、糖含量變化呈顯著相關性，是采后煙葉碳水化合物代謝的關鍵基因；NtAGPS3和NtGBSS1在鮮煙葉中的表達量明顯高于采后煙葉，說明鮮煙葉以淀粉合成代謝為主，采后煙葉淀粉合成代謝迅速減弱，且直鏈淀粉合成速率明顯下降；相關性分析結果表明，直鏈淀粉合成的關鍵酶基因NtGBSS1與豫煙12號淀粉含量變化成顯著正相關，與其他碳水化合物變化相關性較高，是采后煙葉淀粉代謝的關鍵控制基因。可溶性淀粉合成酶（SS）與淀粉粒結合程度較弱，主要參與支鏈淀粉中分支鏈的合成[17]，淀粉分支酶（SBE）的主要功能是水解α-1,4-糖苷鍵，形成α-1,6-糖苷鍵，連接形成支鏈淀粉的分支結構[18]。本研究分析發現，豫煙12號和秦煙96采后煙葉中支鏈淀粉合成相關酶基因NtSS1、NtSS2、NtSBE1和NtSBE的表達量或呈緩慢下降趨勢，或呈逐漸上調趨勢，即采后一定時間內相關基因表達量較高，采后煙葉支鏈淀粉合成代謝減弱緩慢甚至有逐漸加強趨勢。玉米不同淀粉鏈研究[34]中發現，直鏈淀粉比例高，結構致密性強，不易水解。推測采后煙葉內部淀粉形態重新發生分配，直鏈淀粉逐漸向更易水解的支鏈淀粉轉化，為淀粉降解并維持細胞生命活動做準備。擬南芥中包括3種異淀粉酶（ISO1、ISO2和ISO3），在

淀粉合成中起最后修飾作用[19-21]，本研究中NtISO1、NtISO2和NtISO3基因表達量在成熟、采收后呈無序增降模式，這可能與該基因在淀粉合成和降解中的雙重作用有關。淀粉降解主要通過淀粉酶（Ntα-amylase、Ntβ-amylase）和淀粉磷酸化酶(NtSP)進行，且水解和磷酸解兩種途徑均需要R酶（NtSR1）的參與才能徹底完成[22-24]。本研究結果表明，采后煙葉中Ntα-amylase和Ntβ-amylase的表達量較高，說明采后煙葉功能正由積累淀粉向分解淀粉逐漸轉化，采后 30 h內，豫煙 12號Ntα-amylase和Ntβ-amylase表達量呈先升后降趨勢，秦煙96則呈逐漸上調趨勢，這可能與底物即煙葉淀粉含量的多少有關；秦煙96煙葉在采后24～30 h，NtSR1和NtSP的表達量有明顯上調，即秦煙 96采后煙葉較豫煙12號淀粉降解更快、更徹底。

在糖代謝中，蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶是控制碳素分配和流向的關鍵酶，能夠調控植物葉片中蔗糖的合成和總糖的積累[25-27]。液泡轉化酶(VIN)則催化蔗糖分解形成葡萄糖和果糖，參與植物滲透調節和細胞膨大，調控貯藏器官中糖成分及比例[28]。本研究結果發現，豫煙 12號糖代謝相關酶基因NtSPSA、NtSPSB、NtSPSC、NtSPP1、NtSPP2、NtSuS和NtVIN1在采后煙葉中的表達量均呈先上升后下降趨勢，說明采后煙葉糖代謝旺盛，當糖代謝底物消耗殆盡或葉片衰老至一定程度，糖代謝減弱；秦煙96糖代謝相關酶基因表達量則呈明顯上調趨勢，推測秦煙 96成熟煙葉營養物質充實，糖代謝周期持續時間長，因此30 h內糖代謝相關基因表達量持續上調；秦煙 96采后煙葉中糖代謝相關酶基因表達量除NtSuS外均整體強于豫煙12號，即秦煙96采后煙葉糖代謝較豫煙12號更活躍。

4 結 論

本研究結果表明：（1）采后煙葉的淀粉合成代謝減弱，分解代謝加強，NtAGPS1和NtGBSS1是采后離體煙葉中碳代謝途徑的關鍵調控基因；離體煙葉直鏈淀粉合成代謝持續減弱，支鏈淀粉合成代謝減弱緩慢甚至有上調趨勢，推測采后煙葉內部淀粉形態重新發生分配，直鏈淀粉逐漸向更易水解的支鏈淀粉轉化；采后煙葉糖代謝先逐漸旺盛，當糖代謝底物消耗殆盡或葉片衰老至一定程度，糖代謝又減弱；（2）同一生態條件（豫西煙區）和栽培措施下，秦煙96成熟鮮煙葉中淀粉和糖代謝較豫煙12號強，營養物質充實，且采后煙葉中淀粉分解代謝和糖代謝旺盛，碳水化合物降解轉化更加充分；（3）本研究從分子生物學角度分析了同一生態條件下不同烤煙品種采后煙葉淀粉和糖代謝的規律和差異，為進一步探究烘烤過程中煙葉碳代謝規律奠定了試驗基礎和理論基礎。

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