亞麻籽膠低聚糖的制備及其生物活性評(píng)價(jià)

梁 珊 張 寧 韓子晟 黃 玉 汪 勇

(廣東油脂生物煉制工程技術(shù)研究中心；暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系；暨南大學(xué)-薩斯喀徹溫大學(xué)“油料生物煉制與營(yíng)養(yǎng)”聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣州 510632)

亞麻(LinumusitatissimumL.)，又稱胡麻，是世界范圍內(nèi)重要油料作物之一，其種子亞麻籽中含有10%～15%的亞麻籽膠，主要來(lái)源于亞麻籽油加工副產(chǎn)物亞麻籽粕或亞麻籽殼[1]，目前常作為增稠劑、凝膠劑、乳化劑等應(yīng)用于食品、日化及醫(yī)藥行業(yè)[2]，但關(guān)于亞麻籽膠的產(chǎn)品深開(kāi)發(fā)研究還不多見(jiàn)。亞麻籽膠的主要成分亞麻籽多糖是由5～7種單糖通過(guò)一系列特異性糖苷鍵連接而成的聚合物大分子[3]，可通過(guò)物理、化學(xué)或生物的方法降解，從而釋放出小分子低聚糖，可作為制備新型低聚糖的良好資源。酶法是目前制備低聚糖最常用方法，但亞麻籽膠由于其多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，酶法并不能十分有效的降解[4-5]。雙氧水氧化降解法作為一種新型化學(xué)降解方法，在溫度及壓力的共同作用下可表現(xiàn)出很強(qiáng)的降解能力，且其還原產(chǎn)物為水，不會(huì)引入其他雜質(zhì)，綠色安全[6]，可用于亞麻籽膠低聚糖的制備。

目前亞麻籽膠(多糖)及其生物活性已見(jiàn)于報(bào)道，例如降血糖、降膽固醇、減緩胃腸排空速度、抗氧化等[7-10]，但關(guān)于亞麻籽膠的降解及其降解產(chǎn)物生物活性則鮮有報(bào)道。生物活性評(píng)價(jià)是天然產(chǎn)物生物活性成分能否應(yīng)用于功能食品或藥物開(kāi)發(fā)的重要依據(jù)，在食品、生化及醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要意義。本研究針對(duì)傳統(tǒng)酶法降解亞麻籽膠的局限性，采用雙氧水氧化降解法制備亞麻籽膠低聚糖(Flaxseed Gum Oligosaccharides,FGOS)，并采用體外抗氧化及乳酸菌增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了亞麻籽膠降解產(chǎn)物FGOS的生物活性，旨在為更好地開(kāi)發(fā)和利用油料作物亞麻加工副產(chǎn)物亞麻籽膠提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AD高效液相色譜儀(配有ELSD檢測(cè)器)：日本島津公司；Agilent 7820A氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；4000 QTRAP質(zhì)譜儀：AB SCIEX公司；722S可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；Scientz-10N冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 氧化降解法制備FGOS

準(zhǔn)確稱取2.0 g亞麻籽膠(若干份)，磁力攪拌狀態(tài)下加入到100 mL濃度為0.2 mol/L的雙氧水溶液中，螺紋口玻璃瓶密封，置于全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋中，120 ℃反應(yīng)2.0 h，反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻，冰水浴10 min停止反應(yīng)，抽濾，并用蒸餾水反復(fù)洗滌濾餅，合并濾液，采用1%的活性炭在50 ℃下反復(fù)脫色至糖液變?yōu)榈S色或無(wú)色，脫色后的糖液進(jìn)行超濾(截留分子質(zhì)量5 000 Da)處理，濾出液稍濃縮后透析(截留分子質(zhì)量500 Da)除去小分子雜質(zhì)，透析袋內(nèi)截留糖液再經(jīng)濃縮、冷凍干燥后得到FGOS。

1.3.2 FGOS的理化性質(zhì)表征

觀察產(chǎn)品，描述其形態(tài)及色、臭、形等信息；并采用HPLC-SEC及ESI-MS、HPLC-ELSD及GC的方法表征FGOS的特性及單糖組成。ESI-MS條件為[11]：電噴霧(ESI)離子源，正離子模式，質(zhì)量掃描范圍0～1 000m/z，毛細(xì)管電壓40 V，錐孔電壓5 500 V，毛細(xì)管溫度250 ℃；HPLC-ELSD條件為[12]：TSKgel Amide-80 HR色譜柱(4.6 mm ID×25 cm)，洗脫液為乙腈/水=55/45，等度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫80 ℃，ELSD檢測(cè)器；GC樣品前處理及氣相色譜條件參考Chen等[13]的方法進(jìn)行。

1.3.3 FGOS抗氧化活性評(píng)價(jià)

針?biāo)幗Y(jié)合，一直是傳統(tǒng)中醫(yī)的特色，通過(guò)經(jīng)絡(luò)的刺激可以促進(jìn)局部的血液循環(huán)，改善鼻腔通氣，使藥物能更好的發(fā)揮作用。龐智慧等[5]將90例PVOD患者隨機(jī)分為3組，分別予以雙側(cè)迎香穴、上迎香穴和鼻丘針刺，利多卡因迎香穴注射以及單純臨床觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺組和穴位注射組的總有效率分別為44.00%、46.70%，明顯高于空白對(duì)照組，說(shuō)明針刺及穴位注射均能改善PVOD患者的嗅覺(jué)功能。基于“肺開(kāi)竅于鼻，肺與大腸相表里”的機(jī)理，本研究治療采用手陽(yáng)明大腸經(jīng)之合谷、迎香及經(jīng)外奇穴鼻通共奏宣肺氣和通鼻竅之功，取足三里以培補(bǔ)元?dú)?、培土生金，取風(fēng)池、外關(guān)疏風(fēng)解表，配合膀胱經(jīng)拔罐可起到振奮陽(yáng)氣，祛除外邪的作用。

分別測(cè)定FGOS及其對(duì)照物質(zhì)(亞麻籽膠，平行對(duì)照、抗壞血酸或EDTA，陽(yáng)性對(duì)照)的Fe3+還原能力(參考韓林等[14]的方法，還原能力記為As700 nm)、抗脂質(zhì)氧化能力(參考Falkeborg等[15]的方法)、超氧陰離子清除能力(參考敖純[16]的方法)及Fe2+螯合能力，評(píng)價(jià)FGOS的抗氧化活性。Fe2+螯合能力采用鄰菲羅啉比色法測(cè)定：取2.0 mL系列濃度的FGOS溶液(溶于pH 4.5的1.0 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液中)于試管中，加入150 μL 1 μmol/L的硫酸亞鐵溶液(FeSO4·7H2O溶于0.1 mol/L的硫酸溶液中)，混勻并放置10 min后加入250 μL 5 mmol/L的1,10-鄰菲羅啉溶液，混勻顯色10 min后測(cè)510 nm處吸光度值，記為A1，不加FGOS溶液的處理組吸光度值計(jì)為A0，不加硫酸亞鐵溶液的處理組吸光度值計(jì)為A2，F(xiàn)e2+螯合率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。

1.3.4 FGOS乳酸菌增殖活性評(píng)價(jià)

1.3.4.1 菌種活化、培養(yǎng)基配制及滅菌

挑取凍藏的各受試菌株(鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌)接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，取適量的活化菌懸液用0.85%滅菌生理鹽水配制成濃度為107CFU/mL(麥?zhǔn)媳葷岱?的備用菌懸液；分別配制MRS(陽(yáng)性對(duì)照)、MRS無(wú)糖(陰性對(duì)照)、MRS-FGOS、MRS-XOS(陽(yáng)性對(duì)照)以及MRS-亞麻籽膠(平行對(duì)照)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至6.5，控制FGOS、XOS的質(zhì)量濃度為2%，亞麻籽膠質(zhì)量濃度為0.5%，按實(shí)驗(yàn)需求分裝后121 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

1.3.4.2 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)和生長(zhǎng)曲線繪制

采用無(wú)菌操作，將備用菌懸液按照5%(V/V)的接種量接種于培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)60 h，分別在培養(yǎng)0、3、6、9、12、18、24、30、36、48、60 h后，以置于4 ℃冰箱中培養(yǎng)的對(duì)照組為參比測(cè)定600 nm下吸光度值(OD600 nm)，繪制生長(zhǎng)曲線，并分別測(cè)定pH值。

1.3.4.3 短鏈脂肪酸測(cè)定[17]

取2.0 mL發(fā)酵結(jié)束后的乳酸菌菌懸液于10 mL離心管中，加入0.4 mL 50%的硫酸溶液和2.0 mL二氯甲烷，漩渦混勻5 min后10 000 r/min離心5 min，取下層有機(jī)相測(cè)定短鏈脂肪酸含量。采用外標(biāo)法，以乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸5種短鏈脂肪酸為標(biāo)準(zhǔn)品，氣相分析條件為：DB-WAX毛細(xì)管柱、氫火焰檢測(cè)器，載氣為氮?dú)?，分流?0:1，程序升溫，初始溫度70 ℃保持1 min，然后以15 ℃/min升到160 ℃并保持6 min，然后以30 ℃/min升溫至210 ℃并保持5 min，進(jìn)樣口溫度為220 ℃，檢測(cè)器溫度為250 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

1.3.4.4 益生指數(shù)PI值計(jì)算

按公式計(jì)算FGOS及其對(duì)照樣品的益生指數(shù)[18]：

PI=[(APP60-APP0)-(APN60-APN0)]/[(APG60-APG0)-(APN60-APN0)]×100%

式中：APP0和APP60分別為添加特定待評(píng)價(jià)益生成分(FGOS，XOS及亞麻籽膠)培養(yǎng)0 h和60 h后600 nm下的吸光度值；APG0和APG60分別為以MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)0 h和60 h后600 nm下的吸光度值；APN0和APN60分別為以MRS無(wú)糖培養(yǎng)基培養(yǎng)0 h和60 h后600 nm下的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 FGOS的制備及理化性質(zhì)表征

本實(shí)驗(yàn)采用雙氧水氧化降解法以亞麻籽膠為原料制備了FGOS。從外觀上來(lái)看，F(xiàn)GOS是一種淡紅棕色半固態(tài)黏稠狀物質(zhì)(類似麥芽糖飴)，具有特殊香味，水溶性良好，易吸濕，不溶于乙醇及乙醚等有機(jī)溶劑，具有低聚糖的一般特性。由圖1a知FGOS的離子碎片主要是一些小分子糖的二聚體(m/z302.5、318.4、330.4、346.5、353.6)、三聚體(m/z512.7、540.8、563.8)、四聚體(m/z679.7、692.6、701.7)和五聚體(m/z906.0、927.9)。由圖1b可知組成FGOS的共有6種組分，結(jié)合ESI-MS圖譜可知FGOS是聚合度分別為1～6的低聚物的混合物，根據(jù)正相氨基柱的洗脫特性知最先洗脫出來(lái)的小峰(峰1)是一些單糖類物質(zhì)，而第二個(gè)未完全分開(kāi)的峰則可推測(cè)為一些二聚體的異構(gòu)體，其余的峰則分別對(duì)應(yīng)3～6聚體，液相色譜圖進(jìn)一步驗(yàn)證了ESI-MS正離子圖譜的結(jié)果。由圖1c可知，F(xiàn)GOS由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖半乳糖及7種單糖組成，摩爾百分比分別為8.26%、7.54%、12.85%、7.93%、29.31%、14.28%、19.82%。

圖1 FGOS的表征

2.2 FGOS抗氧化活性評(píng)價(jià)

由圖2可見(jiàn)，抗壞血酸表現(xiàn)出了很強(qiáng)的Fe3+還原、抗脂質(zhì)氧化及超氧陰離子清除能力，EDTA也表現(xiàn)出了很強(qiáng)的Fe2+螯合能力；亞麻籽膠的Fe3+還原、抗脂質(zhì)氧化及超氧陰離子清除能力則明顯較弱，但亞麻籽膠表現(xiàn)出了一定的的Fe2+螯合能力。多糖(膠)主要是通過(guò)分子中的羥基、羧基等基團(tuán)與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，從而螯合游離的金屬離子[20]。整體來(lái)看，F(xiàn)GOS表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化活性，而亞麻籽膠的抗氧化活性則較差。

2.3 FGOS乳酸菌增殖活性

2.3.1 FGOS作為碳源對(duì)4種乳酸菌OD值的影響

由圖3可知，4種乳酸菌在以葡萄糖、XOS及FGOS為碳源的培養(yǎng)基上均能夠良好生長(zhǎng)，OD值隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈規(guī)律的“S”型增長(zhǎng)，且很顯然4種乳酸菌利用葡萄糖及XOS的延滯期和對(duì)數(shù)期較短，基本在12 h內(nèi)可達(dá)穩(wěn)定(發(fā)酵乳桿菌利用XOS作為碳源較為特殊，延滯期較長(zhǎng))，相比之下，4種乳酸菌利用FGOS的速度則較為緩慢，需要24 h甚至更長(zhǎng)才能達(dá)到穩(wěn)定。這說(shuō)明4種乳酸菌均能夠利用FGOS進(jìn)行增殖，但利用效率比葡萄糖和XOS低。另一方面，4種乳酸菌利用亞麻籽膠作為碳源的OD曲線則幾乎與MRS無(wú)糖培養(yǎng)基無(wú)異，說(shuō)明4種乳酸菌均不能有效利用亞麻籽膠。4種乳酸菌中植物乳桿菌對(duì)FGOS的利用情況最好，副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌次之，發(fā)酵乳桿菌則較差，這種差異與4種乳酸菌產(chǎn)酶系統(tǒng)的不同有關(guān)[21]，推測(cè)植物乳桿菌產(chǎn)生的酶能夠較好地降解FGOS而產(chǎn)生可利用的單糖，從而表現(xiàn)出較高的益生活性。

圖2 FGOS及其對(duì)照物質(zhì)抗氧化活性

圖3 FGOS及其對(duì)照物質(zhì)對(duì)4種乳酸菌發(fā)酵液OD值的影響

2.3.2 FGOS作為碳源對(duì)4種乳酸菌發(fā)酵液pH值的影響

由圖4可知4種乳酸菌發(fā)酵液pH值的變化趨勢(shì)幾乎與OD值相反，除亞麻籽膠和MRS無(wú)糖培養(yǎng)基之外，發(fā)酵液pH均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，其中FGOS為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵液pH值下降較快，基本上可在9 h內(nèi)達(dá)到最低值，這與OD值的變化規(guī)律稍有差異，說(shuō)明4種乳酸菌在FGOS培養(yǎng)基上代謝產(chǎn)物積累及平衡速度要快于菌體本身的生長(zhǎng)及平衡速度。葡萄糖及XOS為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵液pH值下降程度明顯優(yōu)于FGOS培養(yǎng)基，說(shuō)明4種乳酸菌能夠很好地利用葡萄糖及XOS發(fā)酵產(chǎn)酸，導(dǎo)致發(fā)酵液pH大幅下降，但在12 h之后pH值基本不再變化，即4種乳酸菌在這2種培養(yǎng)基上發(fā)酵產(chǎn)酸可在12 h內(nèi)達(dá)到平衡(發(fā)酵乳桿菌利用XOS為碳源較為特殊，需36 h以上才達(dá)平衡，如圖4b所示)，這與OD值的變化規(guī)律是一致的。4種乳酸菌的亞麻籽膠及MRS無(wú)糖培養(yǎng)基發(fā)酵液pH值則無(wú)明顯變化，說(shuō)明4種乳酸菌不能有效利用亞麻籽膠進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸。4種乳酸菌的FGOS培養(yǎng)基發(fā)酵液pH由低到高依次為，植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌，這與OD值的規(guī)律基本一致。其pH值的差異主要是因?yàn)?種乳酸菌的產(chǎn)酸能力不同，這與它們的代謝系統(tǒng)尤其是酶代謝系統(tǒng)有關(guān)[21]。

圖4 FGOS及其對(duì)照物質(zhì)對(duì)4種乳酸菌發(fā)酵液pH值的影響

2.3.3 FGOS作為碳源4種乳酸菌的益生指數(shù)PI值

益生指數(shù)PI值是反映待評(píng)價(jià)益生物質(zhì)被目標(biāo)益生菌利用情況與葡萄糖的接近程度，其值越高說(shuō)明益生效果越好[18]。由表1可知FGOS對(duì)植物乳桿菌的益生效果最好，可達(dá)到65.58%，其次是副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌，分別為25.51%和24.22%，發(fā)酵乳桿菌則相對(duì)較差，為18.84%。XOS對(duì)4種乳酸菌的益生指數(shù)均較高，亞麻籽膠對(duì)4種乳酸菌的增殖效果較差，益生指數(shù)PI值也相對(duì)較低。

表1 FGOS及其對(duì)照物質(zhì)對(duì)4種乳酸菌的益生指數(shù)PI值/%

2.3.4 FGOS作為碳源對(duì)4種乳酸菌產(chǎn)短鏈脂肪酸的影響

短鏈脂肪酸(SCFA)是一類含2～8個(gè)碳原子的直鏈烷烴羧酸，是益生菌腸道發(fā)酵的重要活性代謝產(chǎn)物[22]。由表2可知4種乳酸菌均可有效利用FGOS為碳源產(chǎn)生SCFA(氣相色譜圖中SCFA各組分分離效果良好)，經(jīng)60 h發(fā)酵后SCFA總產(chǎn)量分別為500.66、295.79、636.32、405.86 μg/mL，整體來(lái)說(shuō)SCFA的總產(chǎn)量為植物乳桿菌>鼠李糖乳桿菌>副干酪乳桿菌>發(fā)酵乳桿菌，這與OD及pH值的規(guī)律是一致的。從SCFA的組分來(lái)看，乙酸含量最高，其次是丁酸和戊酸，丙酸和己酸含量較低。葡萄糖及XOS有很好的SCFA的產(chǎn)生和蓄積能力，亞麻籽膠及MRS無(wú)糖培養(yǎng)基也表現(xiàn)出了微量的SCFA的產(chǎn)生能力，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。4種乳酸菌利用FGOS為碳源SCFA的產(chǎn)量低于葡萄糖及XOS，高于亞麻籽膠，這說(shuō)明雙氧水氧化降解亞麻籽膠制備FGOS的過(guò)程能夠很好地提高亞麻籽膠的益生能力，可為亞麻籽膠產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供一定的依據(jù)。

表2 4種乳酸菌在不同碳源MRS培養(yǎng)基上短鏈脂肪酸產(chǎn)量

注：“—”表示未檢出。

3 結(jié)論

以亞麻籽膠為原料，采用雙氧水氧化降解法制備了聚合度在2～6之間亞麻籽膠低聚糖(FGOS)，由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖7種單糖組成，摩爾比為8.26%、7.54%、12.85%、7.93%、29.31%、14.28%、19.82%；FGOS可線性還原三價(jià)鐵離子，抗脂質(zhì)氧化能力、超氧陰離子清除能力最高分別可達(dá)82.76%、72.93%，是一種潛在的抗氧化劑；FGOS可有效促進(jìn)鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌和副干酪乳桿菌菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酸，益生指數(shù)良好，并能有效蓄積短鏈脂肪酸，具有開(kāi)發(fā)成益生性功能食品的潛力。本研究拓展了油料作物亞麻加工副產(chǎn)物亞麻籽膠的應(yīng)用范圍，為其深度利用及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了參考。

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