鳳丹籽油對肝癌HepG2細胞抑制作用的研究

李梅青 周 鑫 王增蕾

(安徽農業大學茶與食品科技學院1，合肥 230036)

(合肥農產品加工研究院2，合肥 230036)

鳳丹(PaeoniaostiiT.HongetJ.X.Zhang)，因主要產于安徽省銅陵鳳凰山和南陵西山一帶，其具有根粗、粉足、肉厚、木心細、久貯不變質且根皮含丹皮酚等多種生物活性物質的特點，被稱為鳳丹。2011年3月，國家衛生部批準牡丹籽油為新資源食品。目前，能榨油的牡丹籽只有2種：鳳丹、紫斑牡丹。前期對牡丹籽油的研究，大多集中在產自洛陽、菏澤的一些牡丹品種，研究主要為脂肪酸組成、抗氧化、抑菌等。研究發現，采用GC/MS分析牡丹籽油，不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的86.52%～92.00%，其中亞麻酸占37.4%～54.81%，亞油酸占23.26%～33.34%[2-5]。亞麻酸及亞油酸具有降血脂[6-7]、預防心血管疾病[8-9]、抗腫瘤[10]等多種重要生理功能，是營養和保健功能的重要物質基礎。近期試驗研究顯示[11]膳食補充食品功能性脂質多不飽和脂肪酸能夠預防和改善多種炎癥和腫瘤疾病，并且對正常細胞和組織幾乎不會造成損傷。

肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一。我國每年約有38.3萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例數的51%[12-13]，因此有效預防肝癌的發生具有重大意義。由于不同類型以及同類型不同結構的不飽和脂肪酸，對腫瘤的作用差異較大，有的有抑制作用，有的甚至作用相反；濃度的高低也會影響腫瘤的發生、發展[14-16]。鳳丹籽油對腫瘤細胞，尤其是肝癌細胞是否具有抑制作用的研究鮮見報道。本試驗采用GC/MS分析鳳丹籽油脂肪酸組成，質譜庫檢索并結合保留指數驗證，旨在更加精準地確定其脂肪酸組分；通過體外細胞試驗方法，研究鳳丹籽油對人肝癌HepG2細胞增殖抑制作用，為鳳丹籽油作為營養及保健食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鳳丹籽：產自安徽銅陵，采收于2015年，由北京同仁堂安徽中藥材公司提供，晾干后經除雜挑選于4 ℃低溫貯藏，采用索氏抽提獲得鳳丹籽油；正己烷(色譜純)：天津市富宇精細化工有限公司；正構烷烴混標(C7—C40)：Sigma Fluka公司；HepG2細胞株：美國菌種保藏庫(ATCC)；胎牛血清：Biological Industries公司；DMEM高糖培養基、胰蛋白酶、雙抗(青鏈霉素混合液)：HyClone公司；CCK-8細胞增殖與細胞毒性檢測試劑盒：上海貝博生物公司；5-氟尿嘧啶(5-FU)：上海瑞永生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GC/MS-QP2010型氣相色譜/質譜聯用儀：日本島津公司；iMark酶標儀：美國Bio-Rad公司；SC-2556低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；IX51倒置顯微鏡：日本Olympus公司；3111二氧化碳培養箱：賽默飛世爾科技有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：上海鼎科科學儀器有限公司。

1.3 GC/MS分析

1.3.1 甲酯化處理

取鳳丹籽油0.2 g于10 mL刻度試管中，加乙醚/石油醚混合溶劑(體積比為1∶1)2 mL使其溶解，再加入濃度為0.4 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液1 mL，振搖1 min后靜置15 min，加蒸餾水至刻度，靜置使其分層，移出上層液體并加入無水硫酸鈉靜置后稀釋50倍，用0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。

1.3.2 GC/MS分析條件

色譜條件：色譜柱：HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 um)彈性石英毛細管色譜柱；載氣：純度為99.999%的高純氦氣；柱流量：1 mL/min；柱溫程序：初始溫度100 ℃，保持3 min，以7 ℃/min的速度升至190 ℃，保持15 min；再以10 ℃/min的速度升至260 ℃，保持8 min；分流比20∶1；進樣口溫度260 ℃，接口溫度260 ℃；進樣量1.0 μL。

質譜條件：電子源(EI)電離能源：70 eV；EM電壓：1 788 V；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；質量掃描范圍：27～600 amu。

1.3.3 KI值測定[17]

取正構烷烴混標標準品按照試驗條件分析，記錄每個正構烷烴標準品出峰的保留時間，采用保留指數的線性升溫公式：KI=100n+100[(tx-tn)/(tn+1-tn)]，計算各揮發性組分的KI值，式中tx、tn和tn+1(tn

1.4 體外抑制HepG2活性

1.4.1 供試樣品的制備

完全培養基：基礎培養基+10%胎牛血清+1%雙抗(100U/mL青霉素+100ug/mL鏈霉素)。

試驗用鳳丹籽油：分別取適量鳳丹籽油，加入等量的DMSO溶解，用完全培養基稀釋成對應濃度，并使DMSO終濃度均為1%。5-FU：精確稱取適量的5-FU粉末，用完全培養基溶解，得到50μg/mL溶液。均采用0.22μm細胞專用微孔濾膜過濾除菌。

1.4.2 細胞培養

HepG2細胞培養于完全培養基內，37 ℃和5%CO2飽和濕度培養箱中培養。HepG2細胞在培養瓶中呈單層貼壁生長，1～2d傳代1次，取對數生長期的細胞進行試驗。

1.4.3CCK-8法測定鳳丹籽油抑制HepG2細胞增殖活性

本試驗采用CCK-8法是一種新的檢測細胞代謝活性方法，比常用的MTT法靈敏度高，且試劑本身穩定性高，試驗結果更穩定可靠[18]。

收集對數生長期細胞，制備成單細胞懸液進行計數，調整細胞濃度為5×104個/mL接種至96孔板，每孔100μL，待細胞完全貼壁后，小心吸出培養液，分別加入濃度為10、5、1、0.5、0.1μL/mL的試驗用鳳丹籽油，并設有5-FU陽性對照組、正常細胞對照組、溶劑對照組(1%DMSO)、空白組(無細胞，只加培養液)、調零組(加不同濃度含藥培養液)，每組各濃度均設6個復孔。加藥后置于CO2培養箱中分別培養24、48、72h后，加入10μLCCK-8，繼續培養1.5h，在酶標儀上檢測吸光度(OD值)，采用雙波長測定，檢測波長450nm，參比波長655nm。根據公式計算細胞的生長抑制率(IR)。

IR=[1-(給藥組OD值-調零組OD值)/(對照組OD值-凋零組OD值)]×100%

1.4.4 鳳丹籽油對細胞生長曲線的影響

用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后稀釋成6×105、3×105、1.5×105、7.5×104、3.75×104個/mL接種細胞，每個濃度設6個復孔。接種后培養4h使細胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養1.5h后測定OD值，制作出以細胞數量為橫坐標(x軸)，OD值為縱坐標(y軸)的標準曲線。參照方法1.4.3，將得到的吸光度值在標準曲線上計算出相應的細胞數，即可繪出細胞的生長曲線。

1.4.5 數據統計學處理

2 結果與討論

2.1 鳳丹籽油脂肪酸組成及含量分析

對圖1中的各峰的質譜圖進行NIST2011質譜庫檢索，選取相似度高的前10個可能物質，分別通過http://webbook.nist.gov/chemistry/搜索文獻(HP-5柱)得到其保留指數KI值的文獻值，初步確定化學成分。保留指數KI文獻結果與保留指數KI計算結果相比較，以質譜匹配度和保留指數KI值接近度最高的化學結構為最佳鑒定結果，同時運用峰面積歸一化法得各揮發性組分的相對百分含量，結果見表1。

圖1 鳳丹籽油脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖

從表1可以看出，鳳丹籽油經GC/MS分析后共鑒定出10種化合物。飽和脂肪酸有5種，占8.416%，以棕櫚酸(6.137%)、硬脂酸(2.023%)為主；不飽和脂肪酸有4種，占91.494%，其中單不飽和脂肪酸相對質量分數較低，占0.376%，多不飽和脂肪酸相對質量分數高達91.118%(亞油酸30.424%、α-亞麻酸60.694%)；除主要脂肪酸外，還分析出了少量的奇數碳的脂肪酸(十七酸)和酚類。不飽和脂肪酸及亞油酸含量與錢明月等(89%、33.34%)、毛程鑫等(92%、27.58%)和李喜悅

等(>90%、28.0%)的報道接近，而亞麻酸含量遠遠高于毛程鑫等(40.50%)、李喜悅等(44.7%)、王蕓等(37.84%)所報道的，與錢明月等(54.81%)接近。由此可看出，除了品種、氣候條件和生長地域的不同對牡丹籽油脂肪酸組分存在著一定的影響，樣品前處理方式和測定方法等因素也是影響鑒定結果差異的主要原因。

常見食用植物油中不飽和脂肪酸質量分數：橄欖油90.10%、茶油90.10%、葵花籽油86.10%、花生油77.30%、大豆油82.00%、菜籽油80.90%[19]。由此可見，鳳丹籽油的不飽和脂肪酸含量與橄欖油、茶油相當甚至超過，遠高于其他植物油含量。

表2顯示了鳳丹籽油分別作用24、48、72h對HepG2細胞生長的影響。由表2可知，模型組與正常細胞對照組OD值差異不顯著(P>0.05)，說明1%DMSO對HepG2細胞無抑制作用，因此可排除DMSO作為溶劑對考察細胞增殖效果的影響。除低劑量0.1μL/mL外，其他鳳丹籽油劑量組與溶劑對照組OD值均有顯著差異，表明不同劑量鳳丹籽油對HepG2細胞均有抑制作用，但與作為抗癌藥物的5-FU相比，其抑制作用均弱于5-FU。

表1 鳳丹籽油脂肪酸組分及相對含量

表2 鳳丹籽油對HepG2細胞OD值的影響

注：*.與模型組相比，有顯著性差異(P<0.05)；**.與模型組比較，有極顯著性差異(P<0.01)。#.與陽性對照組比較，有顯著性差異(P<0.05)；##.與陽性對照組比較，有極顯著性差異(P<0.01)。

2.2 鳳丹籽油體外抑制腫瘤細胞活性

從圖2可以看出，隨著加入鳳丹籽油劑量的增加，對HepG2細胞的抑制作用也增加，尤其是10μL/mL劑量組的抑制率急劇上升，以作用72h為例，10μL/mL劑量組的抑制率是0.1μL/mL劑量組的13.66倍，呈現明顯的劑量效應。且隨著鳳丹籽油對HepG2細胞作用時間的延長，其抑制率均有上升，以10μL/mL劑量組為例，作用72h的抑制率是24h抑制率的3.71倍，也表現出一定的時間效應。運用改良寇式法[20]計算鳳丹籽油作用72h的IC50為6.05μL/mL。

圖2 鳳丹籽油對HepG2細胞抑制率的影響

2.3 鳳丹籽油對細胞生長曲線的影響

生長曲線體現了細胞在體外培養過程中的增殖動態變化。從圖3可以清晰地看出，鳳丹籽油對HepG2細胞生長曲線的影響。正常細胞對照組的細胞貼壁后生長迅速，細胞數量隨著時間的延長顯著上升，而鳳丹籽油作用后的細胞增殖速度均低于正常細胞。隨著鳳丹籽油劑量的增加，HepG2細胞增長越緩慢，在72h，10、5μL/mL的鳳丹籽油作用HepG2細胞出現負增殖，表現出一定的劑量效應。隨著作用時間的延長，HepG2細胞增殖降低，以10μL/mL劑量組為例，作用72h的細胞數量是48h的0.45倍，出現負增殖，呈現了一定的時間效應。

圖3 鳳丹籽油對HepG2細胞生長曲線的影響

前期資料表明，n3和n6多不飽和脂肪酸的不同配比對腫瘤抑制效果不同[21]，所以調節鳳丹籽油的n3/n6比提高其腫瘤抑制效果，值得進一步關注。本試驗結論僅限于體外細胞試驗，其生物學效應尚需開展動物體內試驗進行考證。

3 結論

利用GC/MS分離檢測，采用峰面積歸一化法估算各組分相對含量，并采用MS譜庫檢索結合保留指數對鳳丹籽油組分進行結構鑒定可知，鳳丹籽油不飽和脂肪酸占91.494%，含量最為豐富的物質為α-亞麻酸(60.694%)，其次為亞油酸(30.424%)。從抑制率、生長曲線可知，鳳丹籽油對HepG2細胞生長增殖有效地抑制，且抑制效果呈現一定的時間、劑量效應。

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