大鼠疑核對內毒素炎癥反應的影響及機制研究

， ， ， 天霞， ，

(山東師范大學 生命科學學院， 山東 濟南 250014)

迷走神經末梢釋放的乙酰膽堿(Ach)[1]與巨噬細胞煙堿型乙酰膽堿受體nAchRα7特異性結合，通過細胞內信號轉導，抑制腫瘤壞死因子TNF-α和白細胞介素4(IL-4)的合成、釋放[2]，并且這些特點在機體的炎癥反應中還可以一起協作，發揮一定功效，減少炎癥反應發生。研究[3-5]證明，內毒素(LPS)炎癥大鼠的迷走傳出神經纖維放電頻率增加，腦干迷走復合體(DVC)中的即刻早期基因(Fos)蛋白表達有顯著的統計學意義，并且膽堿能抗炎癥通路中有DVC的參與。星形膠質細胞參與構成了中樞神經系統的基本骨架，活化的星形膠質細胞顯示出很多功能，當機體受到生理和病理方面的刺激時，星形膠質細胞可以迅速作出反應。膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是存在于中樞神經系統中星形膠質細胞的一種獨立纖維結構蛋白質，是星形膠質細胞的特異性標記物。疑核(NA)與迷走神經背核(DMV)以及孤束核(NTS)作為副交感神經的初級中樞，在功能、結構上存在緊密聯系，而且NA還與DMV構成副交感神經系統節前神經元，它發出的神經纖維組成了迷走傳出神經纖維，由此可推測出NA參與炎癥反應通路。已有研究證明，免疫調節存在單側優勢，大腦的左、右半球在各方面也存在不均衡性。左、右兩側的NA在參與炎癥反應時是否也存在左側優于右側或者右側優于左側的一側優勢，目前鮮有相關文獻研究。本文中通過設計注射LPS致炎癥大鼠的實驗，應用免疫組織化學技術、酶聯免疫等實驗技術，觀察NA中Fos和GFAP的表達以及一些炎癥細胞因子水平的變化，研究NA是否參與炎癥反應。

1 實驗

1.1 材料與試劑

實驗動物雄性Wistar大鼠由山東大學動物實驗中心購買，體質量為(300±20) g；一抗兔抗c-Fos購于圣克魯斯生物技術(上海)公司；一抗兔抗GFAP購于北京博奧森生物技術有限公司；SP系列試劑盒、正常山羊血清購于北京中杉金橋公司；LPS購于美國Sigma公司。

1.2 動物分組

將大鼠隨機分為LPS組和生理鹽水對照組，其中LPS組按照劑量5 mg/kg(每千克大鼠體質量注射5 mg藥物)注射LPS,每組6只，生理鹽水對照組腹腔注射等量的生理鹽水，每組6只。

將大鼠分成以下4組：假損毀左側NA并注射LPS組，6只；損毀左側NA并注射LPS組，6只；假損毀右側NA并注射LPS組，6只；損毀右側NA并注射LPS組，6只。

1.3 NA的定位與損毀

大鼠于實驗前可以正常飲水、進食。對大鼠腹腔注射質量分數為4%的水合氯醛溶液進行麻醉處理，前囟沿正中線向后-12.60 mm、深度9.58 mm、雙側旁開2.1 mm進行NA定位，將損毀電極插入NA中，確保損毀電流的負極與大鼠的皮膚相連，正極在電極上，接通電損毀。手術后再飼養3 d，以進行下一步實驗。大鼠經乙醚輕度麻醉后，腹腔注射LPS。

1.4 TNF-α及IL-4檢測

血樣采集步驟如下：從股動脈取1 mL血樣置于離心管中，用離心機在溫度為4 ℃時離心分離10～15 min，然后將血清放入溫度為-20 ℃的冰箱儲存，備用。

使用ELISA試劑盒檢測樣本， 根據TNF-α和IL-4的檢測范圍， 使用酶標儀測試試樣以及標準樣品的光密度，根據數值繪制標準曲線，然后根據標準曲線算出待測血樣中TNF-α和IL-4的濃度。

1.5 組織準備

灌流、固定、取腦步驟如下：左心室插針達主動脈，用200～300 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)通過大鼠主動脈將腦組織血液沖洗干凈。用250～300 mL質量分數為4%的多聚甲醛(PFA)溶液進行灌流、固定，然后將腦剖出，并放入盛有多聚甲醛的瓶中，在溫度為4 ℃的冰箱再固定6 h，然后放入配好的質量分數為30%的蔗糖溶液中脫水，過夜。在腦沉底后用冰凍切片機進行切片，先粗切修片，再細切留片。將切好的腦片放在PBS中備用。

1.6 免疫組織化學染色

將切好的腦切片用PBS漂洗3次，每次5 min以沖掉包埋劑。然后加入質量分數為3%的過氧化氫與甲醇混合溶液，室溫孵育30 min以消除內源性酶的活性；再加入封閉液，室溫孵育1 h；最后加入兔抗GFAP抗體(用封閉液稀釋，稀釋度為1∶500)或兔抗Fos抗體(用封閉液稀釋，稀釋度為1∶500)，在溫度為4 ℃時孵育過夜；次日拿出復溫30 min，磷酸鹽吐溫緩沖溶液(PBST)沖洗3次，每次15 min，然后依次加入生物素標記山羊抗兔IgG和辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫下各孵育2 h；用二氨基聯苯胺(DAB)顯色液進行避光顯色3～5 min；顯色結束后，用PBS終止顯色漂洗，最后將腦片貼在載玻片上，脫水(質量分數分別為75%、95%、100%的酒精)，透明(二甲苯Ⅰ、Ⅱ)，中性樹膠封片。

1.7 顯微鏡拍照計數與統計學分析

使用顯微鏡觀察腦干DMV和NTS中GFAP或者Fos在免疫組織化學實驗中神經元表達情況；找出所觀察部位，拍照。所有神經元每0.01 mm2的個數均用Image Pro-Plus 6.0 圖象分析軟件統計處理，采用平均數±標準誤差表示，利用統計軟件SPSS 18.0進行數據處理，采用雙尾獨立性樣本t-檢驗比較組間均數。

2 結果與分析

2.1 大鼠血清中TNF-α和IL-4在LPS炎癥中的表達

表1所示為大鼠血清中TNF-α和IL-4在LPS

炎癥中的表達水平。由表可知，與對照組相比，LPS炎癥時大鼠血清中細胞因子TNF-α水平顯著升高(顯著性檢驗水平P<0.05)， IL-4含量增大(P<0.01)。

表1 大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素4(IL-4)在內霉素(LPS)炎癥中的表達水平

2.2 LPS炎癥對大鼠NA的Fos陽性神經元和GFAP陽性星形膠質細胞數量的影響

與對照組相比， NA中Fos陽性神經元個數顯著增加(P<0.05)，GFAP的表達量增加極顯著(P<0.01)，見圖1、表2。由此推斷，在LPS炎癥大鼠模型中，除了神經元參與炎癥反應，星形膠質細胞也參與了炎癥反應。

2.3 LPS炎癥大鼠在電損毀左側NA后血清中TNF-α和IL-4的表達

表3所示為LPS炎癥大鼠在損毀左側NA后血清TNF-α和IL-4水平的變化。由表可知，損毀左側NA與假損毀相比，大鼠血清中抗炎因子IL-4在LPS炎癥中的水平極顯著增大(P<0.01)，而在促炎因子TNF-α中的水平極顯著減小(P<0.01)。由此推測，在正常情況下，左側NA可能對抗炎因子IL-4具有一定的抑制作用，而對于促炎因子起促進作用。

(a)生理鹽水組NA的GFAP陽性星形膠質細胞表達,放大200倍(b)LPS組NA的GFAP陽性星形膠質細胞表達,放大200倍(c)生理鹽水組NA的Fos陽性神經元表達,放大100倍(d)LPS組NA的Fos陽性神經元表達,放大100倍圖1 內霉素(LPS)炎癥時疑核(NA)中即刻早期基因(Fos)與膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達

表2 大鼠穎核(NA)在內霉素(LPS)炎癥中即刻早期基因(Fos)及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達

表3 內霉素(LPS)炎癥大鼠在損毀左側疑核(NA)后血清腦瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素4(IL-4)水平的變化

2.4 電損毀左側NA對LPS炎癥大鼠腦干Fos陽性神經元和GFAP陽性星形膠質細胞數量的影響

與假損毀左側NA相比， 損毀左側NA后， LPS炎癥大鼠腦干中的NTS中GFAP 的表達雖有所增加，然而無統計學意義(P>0.05)，說明左側NA對星形膠質細胞的活性沒有較大影響；而Fos陽性神經元數量顯著增多，陽性神經元的表達情況具有顯著的統計學意義(P<0.01)，說明左側NA對NTS中神經元的激活具有一定的相關性，甚至能夠抑制NTS中某些神經元的表達；DMV中GFAP陽性星形膠質細胞和Fos陽性神經元的數量無統計學意義(P>0.05)，見表4、5和圖2。

表4 內霉素(LPS)炎癥大鼠在損毀左側疑核(NA)后腦干孤束核(NTS)中即刻早期基因(Fos)及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達

表5 損毀左側疑核(NA)對內霉素(LPS)炎癥大鼠腦干迷走神經背核(DMV)中即刻早期基因(Fos)及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達的影響

2.5 電損毀右側NA對LPS炎癥大鼠血清IL-4和TNF-α水平的影響

表6所示為LPS炎癥大鼠在損毀右側NA后血清TNF-α和IL-4水平的變化。由表可知，損毀右側NA并注射LPS組與假損毀右側NA并注射LPS組相比較，IL-4的水平是極顯著增大的(P<0.01)，而血清中TNF-α水平沒有顯著性差別(P>0.05)，這與損毀左側的結果有所不同，因此左、右兩側NA在炎癥中的作用可能存在著一定的差異。

2.6 LPS炎癥大鼠在電損毀右側NA后腦干GFAP和Fos的表達情況

通過注射LPS觀察，比較損毀右側NA與假損毀右側NA，發現大鼠NTS和DMV中GFAP和Fos的表達均無明顯的變化，見表7、8和圖3。由此推測，右側NA對DVC中的神經元及星形膠質細胞無較大的影響。

3 討論

NA是位于腹外延髓的迷走神經核，屬于下橄欖核與三叉神經脊束核之間的特殊軀體運動核和內臟神經核。本課題組的前期研究表明，由LPS所致炎癥大鼠腦干DVC發出的迷走傳出神經纖維放電頻率增加，興奮性增強。同時，LPS大鼠腦干中Fos蛋白表達量顯著增多，證明了DVC參與膽堿能抗炎癥通路。延髓內臟帶核團包括NTS、DMV和NA，NA與DVC不僅在結構和功能上具有密切聯系，并且還與DMV構成了副交感神經系統的節前神經元[6-7]，由DMV發出的神經纖維構成了迷走傳出神經纖維，因此推出NA參與了炎癥反應。

LPS不僅可以促使巨噬細胞產生炎癥細胞因子，還能介導炎癥的發生。謝國旗等[8]的研究表明，在LPS誘導的小鼠肝損傷中，白介素-6和腫瘤壞死因子的含量明顯增大，且與LPS呈顯著的量效關系。張青等[9]研究發現，大鼠肺組織經過不同劑量的LPS致傷后， 劑量加強的促炎因子和抗炎因子的信使核糖核酸(mRNA)表達均增多。 本實驗的研究結果發現， 大鼠腹腔注射LPS 3 h后血清中IL-4及TNF-α的含量也都增大， 且與對照實驗比較，具有顯著的統計學意義，這與文獻[8]中的研究內容結論基本一致。C-Fos是一個傷害性基因以及Fos，當機體受到外周的各種物理化學性刺激時，它可以在其細胞內迅速表達，在感覺神經傳導的神經通路上，多數神經元均會出現Fos蛋白的表達，一般與受刺激的程度成正比[10-11]。研究[12]證實，中樞神經系統中的星形膠質細胞在維持正常生理活動、神經免疫以及神經組織修復與再生中均發揮著重要的作用。GFAP是存在于中樞神經系統中星形膠質細胞的一種獨立纖維結構蛋白質[13-14]，因此本文中用 GFAP來檢測星形膠質細胞的表達，研究發現，經腹腔注射LPS以后，與對照組對比， NA與DMV中GFAP和Fos的表達均有顯著的統計學意義。 由此推測，在構建的LPS炎癥大鼠實驗中，不僅有NA 和DMV 中的神經元參與炎癥反應，星形膠質細胞也共同參與了反應。

(a)假損毀左側NA并注射LPS組NTS與DMV中Fos陽性神經元的表達,放大100倍(b)損毀左側NA并注射LPS組NTS與DMV中Fos陽性神經元的表達,放大100倍(c)假損毀左側NA并注射LPS組NTS與DMV中GFAP陽性星形膠質細胞的表達,放大100倍(d)損毀左側NA并注射LPS組NTS與DMV中GFAP陽性星形膠質細胞的表達,放大100倍圖2 假損毀左側疑核(NA)并注射內霉素(LPS)與損毀左側NA并注射LPS組中大鼠孤束核(NTS)和迷走神經背核(DMV)即刻早期基因(Fos)和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達

表6 內霉素(LPS)炎癥大鼠在損毀右側疑核(NA)后血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素4(IL-4)水平的變化

表7 損毀右側疑核(NA)對內霉素(LPS)炎癥大鼠腦干孤束核(NTS)中即刻早期基因(Fos)及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達的影響

表8 損毀右側疑核(NA)對內霉素(LPS)炎癥大鼠腦干迷走神經背核(DMV)中即刻早期基因(Fos)及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達的影響

(a)假損毀右側NA并注射LPS組NTS與DMV中Fos陽性神經元的表達,放大100倍(b)損毀右側NA并注射LPS組NTS與DMV中Fos陽性神經元的表達,放大100倍(c)假損毀右側NA并注射LPS組NTS與DMV中GFAP陽性星形膠質細胞的表達,放大100倍(d)損毀右側NA并注射LPS組NTS與DMV中GFAP陽性星形膠質細胞的表達,放大100倍圖3 假損毀右側疑核(NA)并注射內霉素(LPS)組與損毀右側NA并注射LPS組大鼠孤束核(NTS)和迷走神經背核(DMV)中即刻早期基因(Fos)和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達

大腦左、 右半球在結構、 功能、 認知活動等方面均具有功能不對稱性[15]。 許多證據表明中樞神經系統可以對細胞因子的產生進行調控。 實驗[16]發現， 切除左側皮質后, LPS誘導巨噬細胞分泌白細胞介素1(IL-1)的含量減少, 與切除右側皮層的結果相反。 已有實驗證明,腦的不對稱性會影響下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸, 在行為不對稱中， 研究上通常將習慣用左手的稱為左利者， 習慣用右手的稱右利者。 有實驗表明， 大鼠腹腔注射LPS模擬炎癥疾病, 左利者、 右利者的大鼠某些激素有所增加， 且增加的程度與大腦的左、右不對稱性有關， 例如， 皮質酮和血漿促腎上腺皮質激素(ACTH)[17]。 從解剖學角度來觀察大腦的海馬等核團與下丘腦存在一定的聯系， HPA軸會因這種聯系而被刺激。 由于海馬區可以調節該軸的興奮性,因此有實驗對海馬中類固醇激素受體的分布進行了研究, 發現右側海馬區表達更高的鹽皮質激素受體與左利鼠密切相關[18]。 本實驗發現損毀左側NA后， 其LPS炎癥大鼠血清中IL-4水平是極顯著增大的， 而TNF-α水平是極明顯減小的， 其中， 左側損毀組IL-4的質量濃度((70.05±10.98)ng·L-1)約是假損毀左側組IL-4質量濃度((23.11±4.76)ng·L-1)的3倍， 假損毀左側組TNF-α的質量濃度((131.22±12.44) ng·L-1)約是損毀左側組TNF-α質量濃度)(70.05±8.01) ng·L-1)的1.9倍，可見左側NA可能對IL-4和TNF-α分別具有不同的作用，一個是抑制，一個是促進。LPS炎癥大鼠損毀右側NA與假損毀右側NA相比，TNF-α的水平沒有顯著變化，其中假損毀右側組TNF-α的質量濃度為(89.98±9.89)ng·L-1，損毀右側組TNF- α的質量濃度為(88.98±8.89) ng·L-1， 可見這與左側變化水平不一致，但是IL-4的水平變化，損毀右側與假損毀右側組相比是極顯著增大的，其中損毀右側組IL-4的質量濃度((49.98±6.01)ng·L-1)約是假損毀左側組IL-4質量濃度((23.08±2.98)ng·L-1)的2倍， 這與損毀左側的結果是相同的。由此可知，左側NA與右側NA 在炎癥反應中的作用可能存在一定的區別。NA與DVC不僅在結構和功能上具有密切聯系，并且還與DMV構成了副交感神經系統的節前神經元。關于在炎癥反應中，NA與DVC是否存在相互作用的問題，本實驗在損毀左側NA后發現， DVC、 NTS中GFAP的表達沒有顯著性差異(P>0.05)， 但是Fos蛋白的表達增加。 損毀右側NA后， 大鼠腦干DVC包括NTS、 DMV中的GFAP和Fos的表達均無統計學意義(P>0.05)。 由此推測， 在炎癥反應過程中， 左側NA可能對NTS中神經元的激活起抑制作用， 而右側NA對DVC中的神經元以及星形膠質細胞無影響。

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