產(chǎn)D-乳酸的德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵工藝研究

韓文靜，梁穎超，陶 進(jìn)，張廣昊

(玉米深加工國(guó)家工程研究中心，吉林長(zhǎng)春 130033)

乳酸又稱丙醇酸，是自然界最小的手性分子，具有L(+)和D(-)2種光學(xué)構(gòu)型[1-3]。D-乳酸作為手性中心，是合成多種手性物質(zhì)的前體，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工等方面應(yīng)用十分廣泛。2000年以后，世界乳酸總生產(chǎn)能力已超過(guò)25萬(wàn)t/a，總產(chǎn)量為13萬(wàn)t/a，并每年遞增[4]。D-乳酸的年生產(chǎn)量約1.6萬(wàn)t，而發(fā)酵法生產(chǎn)D-乳酸的需求量約2.6萬(wàn)t[5]，所以D-乳酸的研究擁有廣闊的市場(chǎng)前景。例如德國(guó)巴斯夫公司生產(chǎn)的S-2-氯丙酸除草劑、日本達(dá)意賽爾生產(chǎn)的對(duì)乙基苯氧丙酸除草劑、德國(guó)赫斯特公司生產(chǎn)的威霸除草劑[4]等。此外，D-乳酸還可用于聚乳酸的生產(chǎn)，根據(jù)生產(chǎn)的聚乳酸的性質(zhì)，可以應(yīng)用于各類食品和化妝品的外包裝材料，在服裝方面也有很好的應(yīng)用前景，可以做成紗、編織物等。

世界乳酸產(chǎn)量的90%是通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)的，其余是化學(xué)合成的。國(guó)際上的D-乳酸生產(chǎn)也主要采用微生物發(fā)酵法[6]。我國(guó)的D-乳酸生產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)需要，生產(chǎn)技術(shù)相對(duì)落后，尤其對(duì)D-乳酸生產(chǎn)菌研究相對(duì)落后[7]。因此，對(duì)D-乳酸產(chǎn)生菌研究是非常重要的。關(guān)于研究發(fā)酵法產(chǎn)D-乳酸的工作有一些報(bào)道，王剛等[8]對(duì)假腸膜明串珠菌進(jìn)行研究，得出該菌的最適生長(zhǎng)溫度為35 ℃，最適pH為6.5，4%初始葡萄糖濃度，6%的接種量，35 ℃有助于發(fā)酵產(chǎn)酸，35 ℃耗糖速度最快。劉海燕等[9]以麥芽汁為培養(yǎng)基發(fā)酵德氏乳桿菌RFXI，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基，使RFXI的活菌數(shù)比優(yōu)化前提高了4.6倍。劉聯(lián)杰[10]對(duì)誘變后的菊糖芽孢乳桿菌進(jìn)行研究，得到發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖152.90 g/L，蛋白胨18.25 g/L，牛肉膏10.00 g/L，酵母抽提物6.25 g/L，磷酸氫二鉀3.00 g/L，乙酸鈉3.00 g/L，七水硫酸鎂0.10 g/L。許婷婷等[11]對(duì)誘變后的乳桿菌進(jìn)行研究，得到該菌株在只含葡萄糖及無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中對(duì)糖的總轉(zhuǎn)化率接近理論最大值，達(dá)到98%，D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到48.5 g/L，光學(xué)純度在99%以上。于培星[12]以凝結(jié)芽孢桿菌JD-063D為出發(fā)菌株，通過(guò)誘變后篩選出一株JD-76D，產(chǎn)酸由出發(fā)菌株的61 g/L提高到145 g/L，D-乳酸純度由原菌株的97.5%增加到98.7%以上。目前鮮見關(guān)于德氏乳桿菌保加利亞亞種生長(zhǎng)的研究報(bào)道。筆者分析了德氏乳桿菌保加利亞亞種在不同條件下的生長(zhǎng)情況，從而篩選出適合其生長(zhǎng)的環(huán)境，為德氏乳桿菌保加利亞亞種產(chǎn)D-乳酸條件摸索及生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。德氏乳桿菌保加利亞亞種，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，玉米深加工國(guó)家工程研究中心活化保藏。

1.1.2培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基：蛋白胨1.000%，牛肉粉0.800%，酵母粉0.400%，葡萄糖2.000%，磷酸氫二鉀0.200%，檸檬酸氫二銨0.200%，乙酸鈉0.500%，硫酸鎂0.020%，硫酸錳0.004%，瓊脂1.400%，吐溫-80 0.100%，118 ℃滅菌15 min，pH 6.3～6.7。種子培養(yǎng)基(MRS肉湯培養(yǎng)基)：蛋白胨1.000%，牛肉粉0.800%，酵母粉0.400%，葡萄糖2.000%，磷酸氫二鉀0.200%，檸檬酸氫二銨0.200%，乙酸鈉0.500%，硫酸鎂0.020%，硫酸錳0.004%，吐溫-80 0.100%，118 ℃滅菌15 min，pH 5.5～5.9。 發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1.000%，牛肉粉0.800%，酵母粉0.400%，葡萄糖7.000%，磷酸氫二鉀0.200%，檸檬酸氫二銨0.200%，乙酸鈉0.500%，硫酸鎂0.020%，硫酸錳0.004%，吐溫-80 0.100%，發(fā)酵前一次性加入碳酸鈣5.000%，118 ℃滅菌15 min，pH 6.4～6.7。

1.2方法

1.2.1產(chǎn)酸量檢測(cè)。采用EDTA定鈣法，按照文獻(xiàn)[13-14]方法進(jìn)行。

1.2.2不同葡萄糖添加量對(duì)產(chǎn)酸量的影響。葡萄糖添加量為2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%，通過(guò)EDTA定鈣法測(cè)定不同葡萄糖濃度的發(fā)酵液中產(chǎn)酸量。

1.2.3不同初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。菌種分別接種在pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%。采用分光光度法在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。

1.2.4不同溫度對(duì)產(chǎn)酸量的影響。培養(yǎng)溫度是細(xì)菌生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素，它可以通過(guò)改變脂肪酸的組成影響細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的組成及其完整[15]。根據(jù)文獻(xiàn)記載，德氏乳桿菌保加利亞亞種生長(zhǎng)溫度為37～45 ℃，當(dāng)溫度高于50 ℃或低于20 ℃時(shí)菌體不能生長(zhǎng)[16]。在其他發(fā)酵條件為最佳狀態(tài)下，選擇生長(zhǎng)溫度分別為36、38、40、42、44、46 ℃，采用EDTA法測(cè)定上述溫度下的產(chǎn)酸量。

1.2.5不同接種量對(duì)產(chǎn)酸量的影響。接種量大小影響菌體生長(zhǎng)速度。過(guò)小，會(huì)延長(zhǎng)菌種生長(zhǎng)的遲緩期，發(fā)酵周期變長(zhǎng)；過(guò)大，會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)剩，菌體利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)自身生長(zhǎng)，不利于產(chǎn)酸。在最佳發(fā)酵溫度、pH、裝液量條件下，接種量分別為6%、8%、10%和12%，測(cè)定產(chǎn)酸量，確定最佳接種量。

1.2.6不同裝液量對(duì)產(chǎn)酸量的影響。裝液量的多少影響發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧值的大小，該試驗(yàn)使用的菌種是兼性厭氧型，溶氧值的大小直接影響產(chǎn)酸量。在其他發(fā)酵條件為最佳狀態(tài)下，裝液量分別為50、75、100、125、150 mL，測(cè)定不同裝液量下的產(chǎn)酸量。

1.2.7發(fā)酵周期對(duì)產(chǎn)酸量的影響。發(fā)酵周期過(guò)短，菌體的生長(zhǎng)不穩(wěn)定，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要提供給菌體生長(zhǎng)，用于產(chǎn)物積累較少；而發(fā)酵周期過(guò)長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡和代謝產(chǎn)物的大量積累使菌體自溶，因此發(fā)酵周期對(duì)菌體的產(chǎn)酸量有很大的影響。在其他發(fā)酵條件最佳狀態(tài)下，在發(fā)酵周期24、32、40、48、56、64、72、78 h的條件下，測(cè)定產(chǎn)酸量。

2 結(jié)果與分析

2.1不同葡萄糖添加量對(duì)D-乳酸產(chǎn)酸量的影響由圖1可知，隨著葡萄糖添加量的增加，產(chǎn)酸量也有明顯的增加，當(dāng)葡萄糖添加量達(dá)7%時(shí)，產(chǎn)酸量最高；但隨葡萄糖添加量繼續(xù)增加，產(chǎn)酸量反而降低。故選擇7%為葡萄糖最佳添加量。

圖1 不同葡萄糖添加量對(duì)D-乳酸產(chǎn)酸量的影響Fig.1 Effect of different glucose additions on D-lactic acid production

2.2不同初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響由圖2可知，當(dāng)初始pH為6.5時(shí)，菌體生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，故發(fā)酵初始pH確定為6.5。

圖2 不同初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of different initial pH on cell growth

2.3不同溫度對(duì)D-乳酸產(chǎn)酸量的影響由圖3可知，隨著溫度的升高，菌體產(chǎn)酸量增加，當(dāng)溫度達(dá)到42 ℃時(shí)產(chǎn)酸量最高，隨著溫度的不斷增加，菌體產(chǎn)酸量開始降低，溫度影響細(xì)胞內(nèi)酶活變化，溫度升高，細(xì)胞內(nèi)酶促反應(yīng)加快，代謝和生長(zhǎng)也相應(yīng)加快；但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，生物活性物質(zhì)發(fā)生變性，細(xì)胞功能下降甚至死亡。故選擇42 ℃為最佳生長(zhǎng)溫度。

圖3 不同溫度對(duì)D-乳酸產(chǎn)酸量的影響Fig.3 Effect of different temperature on D-lactic acid production

2.4不同接種量對(duì)D-乳酸產(chǎn)酸量的影響由圖4可知，隨著接種量的增加，產(chǎn)酸量也不斷增加，當(dāng)接種量為10%時(shí)，產(chǎn)酸量最大，而接種量繼續(xù)增加時(shí)，產(chǎn)酸量反而下降，可能接種量過(guò)大，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分主要用于菌株的生長(zhǎng)，從而造成了產(chǎn)酸量的降低。故以接種量10%為最佳值。

圖4 不同接種量對(duì)D-乳酸產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effect of different inoculum size on D-lactic acid production

2.5不同裝液量對(duì)D-乳酸產(chǎn)酸量的影響由圖5可知，125 mL為最佳裝液量。

圖5 不同裝液量對(duì)D-乳酸產(chǎn)酸量的影響Fig.5 Effect of different liquid loading on D-lactic acid production

2.6不同發(fā)酵周期對(duì)D-乳酸產(chǎn)酸量的影響由圖6可知，在72 h內(nèi)，D-乳酸的產(chǎn)酸量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，而在72 h以后，D-乳酸的產(chǎn)酸量開始減少，故確定72 h為最佳發(fā)酵周期。

圖6 發(fā)酵周期對(duì)D-乳酸產(chǎn)酸量的影響Fig.6 Effect of fermentation period on D-lactic acid production

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)得到產(chǎn)D-乳酸的德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵工藝條件為葡萄糖添加量7%，生長(zhǎng)溫度42 ℃，發(fā)酵周期72 h，初始pH 6.5，接種量10%，裝液量125 mL/250 mL，此時(shí)產(chǎn)酸量最高，為37.8 g/L。

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