地塞米松通過miR-15b誘導(dǎo)急性T淋巴細胞白血病細胞耐藥研究

張妍樂 顧玲 馬志貴（通訊作者）

（四川大學(xué)華西第二醫(yī)院出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點實驗室 四川 成都 610000）

急性淋巴細胞白血病（acute lymphocyte leukemia，ALL）是臨床常見的血液惡性腫瘤，多發(fā)于幼兒群體，具有病情發(fā)展迅速、死亡率高等特點[1]。糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）是ALL的主要治療手段之一，能特異性地調(diào)控細胞周期相關(guān)基因表達，阻滯惡性淋巴細胞增殖和促進其凋亡。但臨床數(shù)據(jù)[2]顯示，目前有超過1/4的兒童ALL患者在治療過程中出現(xiàn)GC耐藥性，影響其治療。微小RNA（microRNA,miRNA）是近年來腫瘤研究的熱點，被證實與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究以人急性T淋巴細胞白血病細胞株CEM-C7為研究對象，分析地塞米松誘導(dǎo)急性T淋巴細胞白血病細胞耐藥性和miR-15b之間的關(guān)系。現(xiàn)具體報告如下。

1.材料與方法

1.1 材料

CEM-C7為人急性T淋巴細胞白血病GC敏感細胞株，由美國E.Brad Thompson教授（University of Texas Medical Branch）提供，胎牛血清購自Hyclon公司、RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司、Trizol購自Invitrogen公司、SYBR Green熒光定量qPCR試劑盒購自日本Takara公司，地塞米松購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購自南京凱基公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司。

1.2 方法

取含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)、傳代CEM-C7細胞。取適量對數(shù)生長期細胞，調(diào)整成2×105/ml的細胞懸液20ml。將細胞懸液充分混勻后隨機分為10ml每培養(yǎng)瓶兩組，1組加入10nmol/L地塞米松，誘導(dǎo)72h后獲得CEM-C7耐藥性細胞株CEM-C7R。另一組加入等體積無水乙醇，常規(guī)培養(yǎng)72h。

之后，CEM-C7R細胞株停用地塞米松，CEM-C7細胞株繼續(xù)使用無水乙醇，兩組細胞株均傳代培養(yǎng)4、8、16、24周。之后均給與10nmol/L地塞米松處理，采用流式細胞儀檢測凋亡情況，比較兩組細胞系的相對存活率。并于培養(yǎng)72h后采用熒光定量RT-PCR檢測微小基因miR-15在兩組細胞系中的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組細胞系的耐藥性檢測

停用地塞米松誘導(dǎo)后，檢測兩組細胞的GC敏感性。傳代培養(yǎng)1、2、4、6個月時， CEM-C7R 細胞組的細胞存活率均高于CEM-C7細胞組，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組細胞系的耐藥性檢測

2.2 兩組細胞系中miR-15b的相對表達水平

相對于CEM-C7細胞中miR-15b的相對表達水平，CEM-C7R細胞中miR-15b的相對表達水平明顯降低，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 兩組細胞系中miR-15b的相對表達水平

3.討論

GC是目前臨床治療ALL腫瘤一線藥物，具有療效顯著、安全性高等特點。但實際應(yīng)用中，部分ALL患者可能出現(xiàn)GC耐藥性，影響治療效果。本研究中，以CEM-C7細胞株為樣本，給予10nmol/L地塞米松誘導(dǎo)72h處理，獲得CEM-C7耐藥性細胞株CEM-C7R。之后對兩組細胞株進行去地塞米松培養(yǎng)1、2、4、8個月。顯示傳代培養(yǎng)1、2、4、6個月時，CEM-C7R細胞組的細胞存活率均高于CEM-C7細胞組（P＜0.05）。可知經(jīng)地塞米松處理后，研究獲得耐藥性細胞株CEM-C7R，CEM-C7R細胞株對地塞米松不敏感。

MiRNA是近年來腫瘤治療的研究熱點，可感染RNA的表達和轉(zhuǎn)錄，進而參與細胞的生命活動，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥、轉(zhuǎn)移等等[3]。miR-15作為近年來被廣泛研究的MiRNA，屬于miR-15/16家族，主要影響細胞的增殖、凋亡以及侵襲等活動。Liang[4]的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-15/16參與調(diào)節(jié)ALL患者的GC敏感性。本研究中，分析兩組細胞株中miR-15的相對表達量。結(jié)果顯示CEM-C7R細胞中miR-15b的相對表達水平與CEM-C7相比明顯降低（P＜0.05），證實miR-15b可能參與了急性T淋巴細胞白血病細胞GC耐藥的獲得，但具體機制尚需進一步研究。

綜上所述，CEM-C7 經(jīng)長期低劑量地塞米松處理后可獲得GC耐藥性，其機制可能與miR-15b有關(guān)。

[1]王慧敏，歐陽涓，滕軍旗，等.地塞米松誘導(dǎo)急性T淋巴細胞白血病細胞耐藥及對miR-15b表達的影響[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2016，16(6):695-698.

[2]王秀月，黨學(xué)娟，汪湄，等.微小RNA在白血病細胞耐藥中的調(diào)控作用研究進展[J].山東醫(yī)藥，2016，56(43):111-114.

[3]張金燕，張桔順，許貞書，等.Notch基因在慢性淋巴細胞白血病細胞的表達和介導(dǎo)抗凋亡、耐藥機制的研究[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2015，23(4):919-924.

[4]Liangju C,Ming Y,Yan C,et al.Roles of miR-15b in endothelialcell function and their relevance to vascular diseases[J].YiChuan,2015,37(2):121-127.