結膜吸吮線蟲基因組中分泌蛋白的規模預測及分析

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結膜吸吮線蟲(ThelaziacallipaedaRailliet and Henry, 1910)[1]，由于其專性寄生于眼部且在亞洲(中國，印度和日本等)最早被發現，故又被稱為“東方眼蟲 (Oriental Eye-worm)”，但結膜吸吮線蟲病卻沒有引起更多臨床醫生和學者的足夠重視。由于其中間宿主岡田繞眼果蠅(Amiotaokadai)的分布較為廣泛，貓、犬等家畜傳染源又難以得到有效的控制，加之社會經濟的發展及城鎮化加速使得結膜吸吮線蟲病的防控面臨許多新的挑戰。隨著英國WTSI對包括結膜吸吮線蟲在內的50種寄生線蟲基因組測序(50-Helminth Genomes)計劃的完成，相關的研究也進入到分子生物學層面，同時這些研究也將推進病原線蟲與宿主互作機制的研究。

寄生蟲侵襲宿主成功的重要的標志往往伴隨著一系列向宿主釋放的蛋白，并且這些蛋白發揮了重要作用。分泌蛋白( Secretory proteins)是生物體在細胞內合成并分泌到胞外發揮功能的一類蛋白的總稱，且其在許多病理生理過程如生長發育、信號轉導中起到了重要作用[2]：如日本血吸蟲分泌蛋白中最大的家族是熱激蛋白HSP70，HSP90等，其在宿主-寄生蟲的免疫調節中發揮重要作用[3]；而曼氏血吸蟲尾蚴的排泄分泌蛋白抗原則能夠在局部皮膚誘導IL-1受體拮抗因子(IL-Ira)來抑制皮膚炎癥反應[4]。近年來測序的普及，尤其是WTSI的“50-Helminth Genomes”計劃，其分泌蛋白組也通過生物信息學預測或實驗的方式迅速獲得。如Fosunyarko等[5]通過對植物寄生線蟲Pratylenchuszeae轉錄測序的方法鑒定了一系列與其取食位點相關的分泌蛋白類致病因子。寄生蟲的分泌蛋白多和其分泌排泄物直接相關，因此對分泌排泄物中組學的研究也獲得了大量有重要功能的分泌蛋白，特別是蠕蟲中排泄分泌抗原的分析：Yatsuda 等[6]在捻轉血矛線蟲(Haemonchuscontortus)分泌蛋白研究中鑒定到107種蛋白，其中就包括與親環素類抗原有較高相似度的新型蛋白分子。

近年來結膜吸吮線蟲的局部流行不容忽視。雖然其基因組測序已完成，但功能基因組研究尚未展開，更是無分泌蛋白方面的研究報道。結膜吸吮線蟲作為一種眼部寄生蟲，由于分子基礎研究仍很薄弱，使得其與宿主之間的分子互作研究也難以深入。因此為了從分子生物學層面研究分泌蛋白在結膜吸吮線蟲與宿主互作中的重要作用，首先從全基因組水平獲得其中具有抗原性的分泌蛋白十分必要。本文正是基于前期對結膜吸吮線蟲基因組數據進行注釋的基礎上，針對分泌蛋白使用標準生物信息學預測流程，對其中的分泌蛋白進行重新預測和定義。綜合使用SignalP等多種生物信息學分析軟件在組學水平上進行大規模篩選，進一步通過提取信息以及結構域數目統計，完成結膜吸吮線蟲中分泌蛋白的 GO 功能富集、KEGG通路以及結構域分析，其結果有望為下一步靶向性開展結膜吸吮線蟲中分泌蛋白的功能研究以及進一步基于分泌蛋白的寄生蟲-宿主互作的分子機制提供借鑒。

1 材料與方法

1.1材料 結膜吸吮線蟲(雄性)的基因組序列來源于NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Thelazia+callipaeda+)。其蛋白序列下載自對其基因組預測的蛋白文件。采用blast-2.2.30+進行本地BLAST(ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov)、SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、在線軟件如，big-PI Predictor(http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html)、 MEME(http://meme-suite.org/)、ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc)、SecretomeP 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/)。

1.2 方法

1.2.1候選分泌蛋白篩選 篩選標準為 ①具有信號肽；②無GPI錨定位點；③無跨膜結構域；本文聯合了 SignalP[7]、TMHMM[8]、big-PI Predictor[9]和 Protcomp 等幾種軟件對結膜吸吮線蟲分泌蛋白的預測[10](圖1)。對經典分泌蛋白信號肽和跨膜結構域的大規模篩選使用了 SignalP 及 TMHMM兩個軟件完成，為了避免預測錯誤并保持預測敏感性，軟件D值采用了系統默認。此外選用真核生物模型、其他參數默認。隨后使用big-PI Predictor 軟件對既具有信號肽又含有跨膜結構域(0 或 1)的氨基酸序列的GPI 錨定位點進行預測。最后，使用 Protcomp 軟件對預測蛋白的亞細胞進行定位。經過前述4步篩選、預測得到蛋白基本可認為是經典分泌蛋白。而對于結膜吸吮線蟲中無信號肽非經典分泌蛋白的預測，本文使用SecretomeP 2.0 軟件[11]進行篩選(不含信號肽，SecP ≥ 0.5)。

圖1 結膜吸吮線蟲分泌蛋白組預測分析流程Fig.1 Flow show of analysis and prediction the secretory protein in Thelazia callipaeda

1.2.2GO功能富集及KEGG通路分析 1)對分泌蛋白的氨基酸序列的GO功能分析采用 Blast2GO進行，并利用Fisher模型進行計算。2)對分泌蛋白的KEGG 代謝通路進行富集分析。首先構建本地化BLAST平臺。然后使用BioEdit (7.2.6)軟件將結膜吸吮線蟲數據庫格式化。使用blastp模式(E-value=10)將分泌蛋白序列比對到結膜吸吮線蟲數據庫中。然后，使用KOBAS軟件(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)對blast比對結果進行 KEGG通路的差異分析。最后，通過程序篩選相關信息，并進行差異倍數計算。通過自編的Python程序提取、統計以及大規模篩選相關信息，從而完成寄生過程相關的分泌蛋白預測，并進行結構域的篩選統計。

1.2.3原位(invivo)表達譜驗證 結膜吸吮線蟲分泌蛋白原位表達譜整合自結膜吸吮線蟲不同發育階段差異基因表達譜的研究，將本文中所得分泌蛋白通過差異基因表達譜進行驗證，進一步確定候選分泌蛋白的原位表達情況。

2 結 果

2.1結膜吸吮線蟲中分泌蛋白的預測 通過前期研究中從頭預測結合同源預測的方法在結膜吸吮線蟲基因組中共獲得6 333個基因，其中包含了5 186個蛋白。使用方法中的生物信息學流程，最終在結膜吸吮線蟲基因組中找到了259個分泌蛋白(圖1)。隨后對這些蛋白的氨基酸數目進行統計，結果表明多數的分泌蛋白長度集中在100-700aa(圖2)，占經分泌蛋白總量的 92.66%。進一步利用擬合指數(R2=0.4)對數據分析，結果顯示伴隨著蛋白長度的增加，其蛋白數目越來越少。由此推測，結膜吸吮線蟲中大多數的分泌蛋白質屬于小型蛋白，所含氨基酸數目一般較少。采用Protcomp軟件對其中不具有GPI脂錨定位點的蛋白進行亞細胞定位預測，結果表明其中186個蛋白分泌到胞外，其余73個蛋白不分泌到胞外(圖3)。這些不分泌到胞外的蛋白中，大都轉運到細胞質膜(8%)、細胞質(6%)、內質網(5%)、線粒體(5%)和溶酶體(2%)。另外，分泌到高爾基體、細胞核、液泡的分泌蛋白占2%。

圖2 結膜吸吮線蟲中分泌蛋白氨基酸長度分析Fig.2 Analysis of amino acid length of secretory protein in Thelazia callipaeda

圖3 結膜吸吮線蟲中不具 GPI 脂錨定位點的蛋白質亞細胞定位預測Fig.3 Prediction of location in subcellular of Thelazia callipaeda proteins without GPI

2.2分泌蛋白功能注釋結果 對候選的259個結膜吸吮線蟲分泌蛋白序列使用 Blast2GO軟件進行 GO 功能分析，并利用 Fisher 模型進行計算(結膜吸吮線蟲基因組作為背景值)。功能富集發現上述蛋白可以被歸到幾大類酶系中，其中分布最多的是水解酶(Hydrolases)(圖 4)，這說明在本研究中使用的雄性成蟲水解酶的活性顯著。通過GO功能富集分析發現刺激響應(GO:0050896)的條目(Term)下顯著富集了一些分泌蛋白，其中為顯著的兩個條目是單生物代謝過程(GO:0044699)和代謝過程(GO:0008152)。為了完成經典分泌蛋白的 KEGG 通路分析，我們通過BLAST將分泌蛋白序列比對到線蟲數據庫中(Wormbase)。然后利用在線軟件KOBAS對數據進行分析，得到這些分泌蛋白KEGG 通路的差異富集。其中主要包括信號轉導、蛋白質修飾、碳水化合物運輸和藥物代謝等(圖 5 )。由此可知，在結膜吸吮線蟲和宿主互作過程中分泌蛋白很可能發揮了著重要的作用。這一結論也可以通過其KEGG過程的功能富集來支持，我們發現分泌蛋白中涉及的糖類代謝相關途徑多數發生了顯著變化：比如，淀粉與蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)、半乳糖代謝(galactose metabolism)、戊糖和糖醛酸轉化途徑(pentose and glucuronate interconversions)及 一些 多 糖 的 降 解(other glycan degradation)等途徑(圖 5)。這也與本研究中發現分泌蛋白中存在種類多樣且數量較多的糖基水解酶結構域的結論相吻合。

圖4 結膜吸吮線蟲中分泌蛋白中的主要酶類Fig.4 Major kinds of enzyme in Thelazia callipaeda secretory proteins

*P-value ≤ 0.05 ；**P-value ≤ 0.01圖5 經典分泌蛋白差異 KEGG 通路分析Fig.5 Analysis of different KEGG pathway of classical secretory proteins

由于結膜吸吮線蟲寄生在宿主過程中可以持續較長時間，因此需要較多的能量，而能量獲取顯得對結膜吸吮線蟲的生存極為重要。測序結果也表明結膜吸吮線蟲許多分泌蛋白參與到糖代謝途徑中，為結膜吸吮線蟲侵襲宿主及長期的寄生生活提供能量。除基本能量代謝途徑外，許多分泌蛋白還參與到了藥物代謝及谷胱甘肽代謝途徑，并且這兩個途徑發生了顯著變化(圖 5)。綜上，這都表明結膜吸吮線蟲分泌蛋白參與糖代謝途徑及對宿主中產生的外源有害物質的代謝可能是其成功侵襲寄主的一個重要機制。

2.3部分結膜吸吮線蟲分泌蛋白具有抗原性 對結膜吸吮線蟲基因組的注釋分析共找到259個分泌蛋白，通過DNASTAR軟件中的Protean模塊預測分析其細胞抗原表位[12]，本研究共發現156個分泌蛋白可能具有較高的抗原性，其中包括許多參與異源物代謝中的關鍵酶，如谷胱甘肽-S-轉移酶(Gultathione S transferase)，硫氧還蛋白過氧化物酶(Thioredoxin Peroxidase)等，其中半胱氨酸[13]則是通過免疫印跡分析發現在華支睪吸蟲中重要的抗原候選分子之一。

2.4結膜吸吮線蟲分泌蛋白序列中保守結構域及功能結構域分析 通過MEME軟件對結膜吸吮線蟲基因組數據中259個分泌蛋白的保守結構域進行分析和信息統計(表1)。統計結果表明，259個分泌蛋白中有30個存在保守的功能結構域，其中8個分泌蛋白還具有兩個或兩個以上的結構域。這些結構域統計結果見表2：其中數目最多的結構域為AT/CCACCA。其次為 AAGCAGC/T、ACTGATAA/T以及AG/CTGG/CTA。另外通過對259個分泌蛋白中所有結構域的篩選，發現含有的糖基水解酶家族的相關結構域最多，約占結構域總數的 20%(82個)。

2.5假定分泌蛋白原位(invivo)表達情況 本文整合了國家自然科學基金項目(81560336)中結膜吸吮線蟲不同發育階段的原位差異表達譜數據，從中獲得了 356 個結膜吸吮線蟲分泌蛋白unigene。通過與這些原位表達的數據進行比對、統計發現，154 個候選分泌蛋白中的在差異基因表達譜中被檢測到，占所有預測分泌蛋白數的59%(圖 6)。Invivo結膜吸吮線蟲原位表達譜數據中表達的 356個分泌蛋白；LSPs：本實驗預測得到的 259 個經典分泌蛋白。

表1 結膜吸吮線蟲分泌蛋白結構域數目
Tab.1 Number of domain in Thelazia callipaeda secretory proteins

PFAMPFAMDomainNo．GlycosylhydrolasesPF007047ZincfingersPF000964RibosomalproteinPF012003LRRPF014632ThioredoxinPF000852

表2 結膜吸吮線蟲分泌蛋白序列中共有的保守域模體及數目
Tab.2 Conserved Domains in Thelazia callipaeda secretory proteins

分泌蛋白中保守結構域Conserveddomainsinsecretoryproteins序列數目DomainNo．AAGCAGC/T4AT/GCACCA6ACTGATAA/T4AG/CTGG/CTA4CAC/TCAGC2CCGGAA1GAAGA/TAA3GA/GTGGTG/A2A/GGTGGA2TACCGAA1TACTGT/CA/T2TATTGA/GTA2TCCAA/GA3TTCTTCTT/C2

圖6 結膜吸吮線蟲分泌蛋白的原位(in vivo)表達情況Fig.6 In vivo expression of Thelazia callipaeda secretory proteins

3 討 論

結膜吸吮線蟲基因組成功測序及序列發布為其分泌蛋白研究提供了重要的數據參考。目前已知寄生線蟲分泌蛋白與其能否寄生成功有密切關系。因此，在基因組水平研究結膜吸吮線蟲的分泌蛋白特點，將有助于從分子層面了解其致病過程的概況。本文使用的結膜吸吮線蟲為雄性成蟲，雖然已經完成了其基因組序列的組裝，但是并沒有對其中的基因結構、基因功能做出分析。而目前完成測序的許多寄生蟲基因組中，很多已經首先完成了分泌蛋白及其抗原性的分析，比如血吸蟲[14]、肝片吸蟲[15]、鉤蟲[16]等。由此可見，在和健康密切相關的寄生蟲中分泌蛋白普遍存在，并且和其寄生過程密切相關。

通過生物信息學方法，在結膜吸吮線蟲中最終獲得了259個分泌蛋白。通過對其氨基酸數目的統計，發現大多數的分泌蛋白長度集中于100～700aa，屬于小型蛋白。另外，功能富集分析發現，分泌蛋白在結膜吸吮線蟲-宿主互作過程中可能起著非常重要的作用。由于在許多已知寄生線蟲研究中發現的分泌蛋白也多為小型蛋白。由此推測，正是因為結膜吸吮線蟲中分泌蛋白多為小型蛋白，所以其結構較為簡單，因此更加方便其在與宿主的互作中發揮作用。依據預測的蛋白功能，推測這些蛋白可能參與：①抗氧化活性；②協助蟲體的入侵及在宿主體內的移行。

另外，在我們對結膜吸吮線蟲的不同發育階段差異基因表達譜實驗研究中發現：本文預測的189個分泌蛋白在不同的發育階段有差異表達，這更是有力的證據證明結膜吸吮線蟲寄生宿主過程中，分泌蛋白可能發揮著極其重要的作用。本文的研究發現，結膜吸吮線蟲分泌蛋白的主要組分之一是脂肪酸結合蛋白，其他蛋白組份還包含剪接體、 RNA 運輸體等。此外參與氨基酸降解的蛋白也占很大比例，這表明這些蛋白分子在宿主-寄生蟲的免疫調節中發揮重要作用。眾所周知，抗原刺激是宿主免疫應答產生、維持及調控的重要始動因素之一。往往不同來源的蟲體都含有特異性抗原成分，因而引起的宿主免疫應答機制和結果也不完全相同。而其中最受關注的是可與宿主免疫系統直接接觸的抗原，如蟲體的排泄/分泌抗原，像在肝片吸蟲中發現的具有候選藥物靶標性的組織蛋白酶L和華支睪吸蟲中的半胱氨酸蛋白。除了免疫學方面的關注外，還發現血吸蟲在小鼠體內寄生時免疫反應產生的一些分子可以促進小鼠自身的生長發育[17]。因此，采用生物信息學技術大規模分離篩選蟲體的分泌蛋白及其表達譜，可為鑒定可能與誘導宿主免疫應答、免疫調節、免疫逃避等相關的重要抗原分子提供信息，是了解結膜吸吮線蟲與宿主之間的免疫學相互適應的重要途徑之一。文中鑒定的其他分泌蛋白還有氨肽酶、烯醇酶等。這些蛋白主要是由一些與結膜吸吮線蟲生命代謝、生長發育、免疫調控相關的蛋白組成，其中硫氧還蛋白過氧化物酶、谷胱甘肽轉移酶是高豐度的分泌蛋白。此外，還在數據庫中鑒定到2種免疫調節相關的蛋白。

作為一種能夠在較長時間(2-3年)內寄生在宿主眼部的寄生線蟲，結膜吸吮線蟲如何逃避宿主免疫效應、其自身能量代謝過程及如何利用宿主成分這些問題的闡明就顯得十分重要。雖然分泌蛋白具有水解一些蛋白類成分的功能的研究已經不少，但結膜吸吮線蟲分泌蛋白在糖代謝途徑中的作用卻所知甚少。文中通過KEGG 富集分析，分泌蛋白大量參與了淀粉、蔗糖、半乳糖、戊糖和糖醛酸等多條代謝轉化途徑以及其他多糖的降解等途徑，且這些代謝發生了顯著變化。此外，本文還發現分泌蛋白中占優勢的結構域為糖基水解酶結構域，這也從另一方面佐證了眾多的分泌蛋白參與到糖代謝途徑當中，為結膜吸吮線蟲提供所需的能量從而在其入侵及長期寄生的過程發揮作用。

位于N端的信號肽引導核糖體到達內質網從而完成多肽的合成，因此是分泌蛋白重要特征。而現實中除了經典分泌蛋白，在動植物中還普遍存在一種不含信號肽的分泌蛋白，如人的內質網、高爾基體中就存在大量不具有信號肽的蛋白質。雖然目前有學者在寄生蟲中鑒定到了一些不具有信號肽的非經典分泌蛋白[18-19]，但有關研究依然較少。本文通過對結膜吸吮線蟲基因中分泌蛋白的全面預測，鑒定了許多非經典分泌蛋白，同時結合其表達譜數據更加確定了這些潛在的非經典分泌蛋白。因此，這些非經典分泌蛋白的生物學意義將隨著結膜吸吮線蟲基因組及分泌蛋白組的研究的不斷加深，非經典分泌蛋白的功能也會得到很好的詮釋。

4 結 論

本研究通過標準的生物信息學分析流程，第一次系統預測并分析了結膜吸吮線蟲基因組中的全部分泌蛋白，共找到259個分泌蛋白。進一步通過大規模數據分析的方法預測了這些分泌蛋白功能，結果發現其在結膜吸吮線蟲與宿主互作過程中可能起到了重要的作用，如維持自身生長的能量代謝過程。結合結構域的分析結果，發現最多的結構域為糖水解酶結構域，從而佐證了結膜吸吮線蟲分泌蛋白在能量代謝中發揮著重要作用這一推測。此外，還發現這些分泌蛋白中近半數(49%)具有抗原性，也進一步證實了其在與宿主互作中的重要功能。

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