兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

牛江婷，方 詞，伊淑帥，張 雙，何羽揚(yáng)，董國(guó)英，胡桂學(xué)*(.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 308；.北京師范大學(xué)全球變化與地球系統(tǒng)科學(xué)研究院，北京 00875)

支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabroncbispetica,Bb)與百日咳桿菌(Bordetellapertussis,Bp)、副百日咳桿菌(Bordetellaparapertussis,Bpp)同屬于波氏桿菌屬，是一種寄生在人、哺乳動(dòng)物或家禽呼吸道上皮纖毛上的革蘭陰性短桿菌，感染后主要引起呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致急性死亡[1-2]。兔的波氏桿菌病是由兔支氣管敗血波氏桿菌(又稱(chēng)為兔博德特氏桿菌)引起的一種以鼻炎、支氣管肺炎以及膿皰型肺炎為主要臨床癥狀的呼吸道傳染病，常與兔多殺性巴氏桿菌、葡萄球菌以及鏈球菌混合感染，造成養(yǎng)殖場(chǎng)兔群的急性發(fā)病和大量死亡[3-4]。近年來(lái)，隨著集約化家兔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展以及家兔引種與頻繁貿(mào)易，波氏桿菌在兔群中廣泛傳播，給家兔養(yǎng)殖帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。針對(duì)這一現(xiàn)象，抗生素類(lèi)藥物作為強(qiáng)有效的預(yù)防及治療措施受到養(yǎng)殖戶(hù)的歡迎，但藥物的過(guò)量使用與濫用造成的耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重。因此，對(duì)地方或“自家”菌株進(jìn)行耐藥性分析，對(duì)臨床合理用藥具有重要的指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)從內(nèi)蒙古海拉爾區(qū)某規(guī)模化兔場(chǎng)病死兔肺臟內(nèi)成功分離到一株細(xì)菌，經(jīng)鑒定為支氣管敗血波氏桿菌，并對(duì)其進(jìn)行了藥物敏感試驗(yàn)和部分耐藥基因檢測(cè)，以期為當(dāng)?shù)赝脠?chǎng)波氏桿菌病的合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 2017年4月，內(nèi)蒙古海拉爾區(qū)某規(guī)模化兔場(chǎng)2～4月齡兔群突然出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振、咳嗽、打噴嚏、鼻分泌物增多等臨床癥狀，5～7 d后病兔大量死亡。對(duì)病死兔進(jìn)行剖撿，肉眼觀察各組織器官，無(wú)菌采集肺臟、肝臟及心血，-20 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 綿羊鮮血瓊脂平板、TSA瓊脂平板購(gòu)自南京一基生化科技有限公司；革蘭染色試劑盒、細(xì)菌微量生化鑒定管購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit、Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；2×premix rTaq、pMD18-T Vector Cloning Kit、E.coliDH5α購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 主要儀器 MCO-18AIC恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)、MCV131BNF超凈無(wú)菌工作臺(tái)(日本SANYO公司)、MikRo 22R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)HETTICH公司)、UV-2012PCS氣浴恒溫?fù)u床(龍尼柯儀器有限公司)、g1000 PCR基因擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)、全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離純化 取無(wú)菌采集的病變組織，選擇新鮮創(chuàng)面分別于TSA、鮮血瓊脂平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，37 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)24～48 h，觀察病原菌生長(zhǎng)狀態(tài)，挑取單一優(yōu)勢(shì)菌落繼續(xù)純培養(yǎng)。

1.2.2 染色、鏡檢 取少量分離菌純培養(yǎng)物涂片，進(jìn)行革蘭染色，油鏡下觀察病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色特點(diǎn)。

1.2.3 生化試驗(yàn) 將分離菌純培養(yǎng)物接種于含5%胎牛血清的液體LB培養(yǎng)基中，取少量菌液加入微量生化鑒定管中，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2.4 PCR鑒定 使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取分離菌全基因組，分別采用16s rRNA通用引物與兔波氏桿菌鑒定引物[5]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并進(jìn)行膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，提取陽(yáng)性質(zhì)粒送往上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.2.5 藥物敏感性試驗(yàn) 以Kirby-Bauer(K-B)氏法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測(cè)量病原菌的抑菌環(huán)直徑，參考美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.6 耐藥基因檢測(cè) 參照分離菌株藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選取β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因blaTEM[6]、blaCTX-M[6]，四環(huán)素類(lèi)耐藥基因tetA[7]、tetB[7]，環(huán)胺類(lèi)耐藥基因sul1[7]，氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aadA1[7]進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序與基因比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離 病變組織經(jīng)平板劃線，于37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，鮮血瓊脂平板上呈現(xiàn)出表面光滑，邊緣整齊，中間稍隆起的灰白色圓形菌落，直徑約1 mm，周?chē)纬呻[約可見(jiàn)的β-溶血環(huán)；在含5%胎牛血清的TSA培養(yǎng)基上形成致密、光滑、稍有凸起的黃白色菌落。

2.2 染色、鏡檢及形態(tài)觀察 經(jīng)革蘭染色后，油鏡下觀察該病原菌為兩極濃染，兩端鈍圓的革蘭陰性短桿菌，菌體大小均一，部分成對(duì)存在。

2.3 生化試驗(yàn) 采用微量生化鑒定管對(duì)該株分離菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。該菌不發(fā)酵蔗糖、乳糖、葡萄糖等糖類(lèi)以及甘露醇等醇類(lèi)；吲哚試驗(yàn)、M-R、V-P試驗(yàn)均呈陰性，不產(chǎn)生硫化氫；可利用枸櫞酸鹽，還原硝酸鹽，氧化酶、接觸酶、谷氨酸脫羧酶、脲酶反應(yīng)呈陽(yáng)性；生化鑒定結(jié)果與《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中波氏桿菌的描述一致，初步確定該分離菌株為波氏桿菌。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果Tab 1 Biochemical identification results of isolated strain

"+"表示陽(yáng)性，"-"表示陰性。

"+" indicated positive, and "-" indicated negative.

2.4 PCR鑒定結(jié)果 16s rRNA通用引物擴(kuò)增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得大小約為1500 bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1A)；支氣管敗血波氏桿菌鑒定引物擴(kuò)增出大小約為425 bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1B)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast在線比對(duì)，與波氏桿菌同源性高達(dá)99.8%，確定該分離株為兔源支氣管敗血波氏桿菌。

2.5 藥物敏感性試驗(yàn) 該分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表可知，該菌株對(duì)卡那霉素、慶大霉素、諾氟沙星、甲氧嘧啶高度敏感；對(duì)強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星等中度敏感；對(duì)青霉素G、阿莫西林、頭孢拉啶、四環(huán)素等耐藥。

2.6 耐藥基因檢測(cè) 采用文獻(xiàn)中的引物檢測(cè)分離菌的6種耐藥基因，共篩選出blaTEM與tetB兩種耐藥基因，未檢測(cè)到blaCTX-M、tetA、sul1與aadA1耐藥基因的存在。圖2為耐藥基因blaTEM與tetB的檢測(cè)結(jié)果，分別于300 bp與350 bp左右出現(xiàn)目的條帶，與目的擴(kuò)增條帶305、374 bp一致。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI在線比對(duì)，與已發(fā)表的豬源支氣管敗血波氏桿菌、兔源波氏桿菌、肺炎克雷伯氏菌和沙門(mén)菌相關(guān)耐藥基因同源性為99.3%～99.9%。

A：16s rRNA通用引物擴(kuò)增結(jié)果。M，DL200 DNA Maker；1，分離株菌液；2，分離株基因組DNA B：波氏桿菌鑒定引物擴(kuò)增結(jié)果。M，DL200 DNA Maker；1，分離株基因組DNA；2，陰性對(duì)照A: Amplification results of 16s rRNA universal primers.M, DL200 DNA Maker; 1, bacteria liquid; 2, genome DNA of isolated strain B: Amplification results of Bb' appraisal primers.M, DL200 DNA Maker; 1, genome DNA of isolated strain; 2, negative control圖1 PCR擴(kuò)增電泳圖Fig 1 Amplification electrophoresis of PCR

表2 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Drug sensitive test results of isolated strain

M：DL200 DNA Maker；1：blaTEM基因(305 bp)；2，tetB基因(374 bp)M:DL200 DNA Maker;1:blaTEM gene (305 bp);2:tetB gene (374 bp)圖2 耐藥基因檢測(cè)電泳圖Fig 2 Tested electrophoresis of resistance gene

3 討論與小結(jié)

兔細(xì)菌性呼吸系統(tǒng)疾病的病原主要包括支氣管敗血波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、葡萄球菌、大腸桿菌與鏈球菌等。其中，波氏桿菌與巴氏桿菌是規(guī)模化兔場(chǎng)多發(fā)的呼吸道病原菌，常混合感染，造成兔群的支氣管肺炎與膿皰型肺炎，導(dǎo)致兔群急性死亡，制約兔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。由于波氏桿菌與巴氏桿菌在培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)以及生化特點(diǎn)等方面具有很大的相似性，給臨床診斷工作造成了極大地困難。實(shí)驗(yàn)從發(fā)病兔群肺臟中成功分離到一株細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)特性觀察、革蘭染色、生化鑒定以及PCR鑒定確定為支氣管敗血波氏桿菌。為了解該兔場(chǎng)所在地區(qū)兔波氏桿菌的耐藥情況，對(duì)該分離株進(jìn)行了藥物敏感性試驗(yàn)與耐藥基因檢測(cè)。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)與四環(huán)素類(lèi)抗生素的耐藥最為嚴(yán)重，其中對(duì)青霉素G、阿莫西林、頭孢拉啶完全耐藥，對(duì)氨基糖苷類(lèi)與喹諾酮類(lèi)抗生素高度敏感(表2)。該分離菌株的耐藥情況與以往報(bào)道的結(jié)果存在相似性，但是也存在不同。王曉芳等[6]對(duì)分離自浙江省的22株兔支氣管敗血波氏桿菌耐藥情況進(jìn)行了分析，分離菌株對(duì)林克酰胺類(lèi)與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥嚴(yán)重，耐藥率達(dá)到91.0%～100%，對(duì)青霉素、頭孢拉啶、林可霉素的耐藥最為嚴(yán)重，但是，對(duì)四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素高度敏感。李長(zhǎng)安等[8]對(duì)陜西某兔場(chǎng)波氏桿菌分離株耐藥性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星等抗生素高度敏感，對(duì)紅霉素、四環(huán)素等抗生素耐藥。馬增暉，王孝友等[9-10]研究結(jié)果均表明兔波氏桿菌對(duì)卡那霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星高度敏感。由于不同地區(qū)流行毒株與抗生素使用情況的差異，導(dǎo)致波氏桿菌地區(qū)分離株耐藥性存在著差異，但綜合近年來(lái)波氏桿菌耐藥性研究結(jié)果，波氏桿菌普遍對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥，對(duì)氨基糖苷類(lèi)與喹諾酮類(lèi)抗生素高度敏感。這一結(jié)果對(duì)兔場(chǎng)波氏桿菌病的臨床用藥具有指導(dǎo)意義。

耐藥性基因檢測(cè)結(jié)果顯示，該分離菌株攜帶有β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因blaTEM與四環(huán)素類(lèi)耐藥基因tetB，耐藥基因檢測(cè)結(jié)果與藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致。細(xì)菌產(chǎn)生的TEM性β-內(nèi)酰胺酶是介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的主要原因，編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因主要由質(zhì)粒攜帶，并可通過(guò)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)與接合等方式轉(zhuǎn)移給其他非耐藥菌，造成耐藥菌株的普遍存在[11-12]。王曉芳等[6]檢測(cè)到blaTEM耐藥基因在兔源波氏桿菌內(nèi)廣泛存在，與研究結(jié)果一致。blaTEM耐藥基因的廣泛存在解釋了兔波氏桿菌對(duì)青霉素G、阿莫西林、頭孢拉啶等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素普遍耐藥的現(xiàn)象。該分離株檢測(cè)到tetB耐藥基因，并對(duì)四環(huán)素類(lèi)耐藥，可能是當(dāng)?shù)赝脠?chǎng)大量使用四環(huán)素類(lèi)抗生素造成菌株變異，產(chǎn)生對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素的耐藥性。

伴隨著兔養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，抗生素的使用量也會(huì)大量增長(zhǎng)，隨之而來(lái)的細(xì)菌耐藥現(xiàn)象也應(yīng)受到廣泛重視。兔波氏桿菌作為一種潛在的人畜共患病原菌，耐藥菌株的出現(xiàn)不僅會(huì)制約兔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，也會(huì)對(duì)人類(lèi)健康造成巨大威脅。因此，了解地方菌株的耐藥情況與耐藥基因攜帶情況，可為臨床上抗生素的合理使用提供參考，也可以盡量減少耐藥菌株的出現(xiàn)，對(duì)公共生物安全具有重要意義。

[1] Garcia D C, Guzman L, Cano M E,etal. Microbiological and clinical aspects of respiratory infections associated withBordetellabronchiseptica[J]. Diagn Micr Infec Dis, 2015, 82(1): 20-25.

[2] Wernli D, Emonet S, Schrenzel J,etal. Evaluation of eight cases of confirmedBordetellabronchisepticainfection and colonization over a 15-year period [J]. Clin Microbiol Infec, 2011, 17(2): 201-203.

[3] Yoda H, Nakayama K, Nakagawa M. Experimental infection ofBordetellabronchisepticato rabbits [J]. Jikken Dobutsu Experimental Animals, 1982, 31(2): 113-118.

[4] 劉 燕, 韋 強(qiáng), 肖琛聞, 等. 兔波氏桿菌研究進(jìn)展及防控對(duì)策思考[J]. 中國(guó)養(yǎng)兔雜志, 2014, (4): 36-38.

Liu Y, Wei Q, Xiao C W,etal. The research progress and prevention and control anlysis onBordetellabronchisepticaof rabbit [J]. Chinese Journal of Rabbit Farming, 2014, (4): 36-38.

[5] 劉 燕, 韋 強(qiáng), 肖琛聞, 等. 兔巴氏桿菌和波氏桿菌多重PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012, 32(2): 248-251.

Liu Y, Wei Q, Xiao C W,etal. Establishment of duplex PCR assay for the diagnosis ofPasteurellamultocidaandBordetellabronchisepticainfection in rabbits [J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2012, 32(2): 248-251.

[6] 王曉芳, 劉 燕, 肖琛聞, 等. 兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及耐藥基因檢測(cè)[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī),2015,42(3):544-548.

Wang X F, Liu Y, Xiao C W,etal. Isolation, Identification and Detection of Drug Resistant Genes of RabbitBordetellabronchiseptica[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2015, 42(3): 544-548.

[7] 劉芳萍, 趙玉林, 李昌文, 等. 雞源性沙門(mén)氏菌耐藥基因檢測(cè)與耐藥相關(guān)性分析[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 35(8):627-630.

Liu F P, Zhao Y L, Li C W,etal. Drug resistance gene detection and the resistance correlation analysis inSalmonellaisolated from chickens [J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2013, 35(8):627-630.

[8] 李長(zhǎng)安, 方艷琴, 陳曉霖,等. 兔支氣管敗血波氏桿菌的分離與鑒定[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 20(10):16-19.

Li C A, Fang Y Q, Chen X L,etal. Isolation and Identification ofBordetellabronchisepticaof Rabbit[J]. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 2011, 20(10):16-19.

[9] 馬增暉, 尹秀鳳, 薛家賓, 等. 家兔支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定[J]. 中國(guó)養(yǎng)兔雜志, 2008 , (5): 24-26.

Ma Z H, Yin X F, Xue J B,etal. Isolation and Identification ofBordetellaBronchisepticaof Rabbit [J]. Chinese Journal of Rabbit Farming, 2008, (5): 24-26.

[10] 王孝友, 楊 睿, 王永康, 等. 兔波氏桿菌的分離與鑒定[J]. 中國(guó)養(yǎng)兔雜志, 2012, (3): 8-10.

Wang X Y, Yang R, Wang Y K,etal. Isolation and Identification ofBordetellaBronchisepticaof Rabbit [J].Chinese Journal of Rabbit Farming, 2012, (3): 8-10.

[11] Bailey J K, Pinyon J L, Anantham S,etal. Distribution of the blaTEM gene and blaTEM-containing transposons in commensalEscherichiacoli[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2011, 66(4): 745.

[12] Wilke M S, Lovering A L, Strynadka N C. Beta-lactam antibiotic resistance: a current structural perspective [J]. Current Opinion in Microbiology, 2005, 8(5): 525-533.