楓蓼醇提液槲皮素含量測定及藥效

高 彪，彭新宇，袁明貴，徐志宏(廣東省農業科學院動物衛生研究所 農業部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室廣東省中獸藥工程技術研究中心,廣州 510640)

楓蓼制劑是由牛耳楓及辣蓼這兩味藥材共同組成，是傳統民間方劑。牛耳楓(DaphniphyllumcalycinumBenth.)又稱牛耳鈴，是屬虎皮楠科(Daphniphyllaceae)虎皮楠屬植物，主要分布于我國海南、廣東、江西、福建等省份，具有活血散瘀、祛風止痛、止痢清熱等功效，主治痢疾、風濕骨痛、感冒發熱等疾病。辣蓼(polygonumhydropiperL)又稱柳蓼，為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(polygonum)植物。廣泛分布于我國廣東、云南、海南、臺灣等省市[1]，具有止痢、活血化瘀、止癢殺蟲等功效，主治腹瀉、腸胃炎、風濕性關節痛、跌打損傷等[2-4]。

現代中藥藥理研究發現，黃酮類化合物是辣蓼與牛耳楓中的主要活性物質，研究表明黃酮類化合物具有抗氧化，抗炎，鎮痛等作用[5]。目前從辣廖和牛耳楓中分離的主要黃酮類化合物有蘆丁、槲皮素等。其中槲皮素含量可用作評價其質量的定量標準之一，快速、準確的測定方法具有重要意義。通過熱板法、醋酸扭體法、二甲苯誘發小鼠耳廓腫脹法及醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性影響，研究了楓蓼乙醇提取液的抗炎、鎮痛活性效果，為臨床應用提供了科學的依據[6-7]。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 RE-5399型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；SB25-12DT型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Metter-Toledo-xs型十萬分之一天平(瑞士梅特勒公司)；SHZD-D(Ⅲ)型循環式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)。

1.2 主要材料 牛耳楓藥材購于廣東茂名(批次201507)；辣蓼藥材購于廣東茂名(批次201508)；羅通定(批號A160101 山西云鵬制藥有限公司)；腸胃康(批號151002，海口市制藥廠有限公司)；阿司匹林(批號160102，湖南新匯制藥股份有限公司)；伊文斯蘭(批號20130218，國藥集團化學試劑有限公司)；二甲苯、乙醇、醋酸均是分析純。

試驗動物:昆明小鼠，SPF級別，體重18～22 g，雌雄各半，采購于南方醫科大學的試驗動物中心(合格證號：SCXK(粵)2011-0015)。

1.3 試驗方法

1.3.1 楓蓼藥材中槲皮素含量測定

1.3.1.1 最佳吸收波長的選擇 精密稱取槲皮素對照品，甲醇溶解，定容，制得每1 mL含20 μg的槲皮素標準溶液，采用二極管陣列檢測器對標準品進行200～400 nm掃描。

1.3.1.2 流動相的選擇 本試驗研究比較了乙腈、甲醇有機相與水或不同濃度磷酸之間的組合，也對柱溫、梯度洗脫方法及流速進行了考察。

1.3.1.3 對照品的配制 精密稱量10 mg槲皮素對照品于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解，冷卻至室溫，加適量甲醇定容至刻度，搖勻，制得槲皮素標準品溶液(每1 mL含槲皮素1.00 mg)。分別精密移取槲皮素對照品0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得濃度為10、20、30、40、50 μg/mL的標準品溶液。0.45 μm有機濾膜濾過，備用。

1.3.1.4 供試品的配制 精密稱取楓蓼粉末20 g(牛耳楓∶辣蓼=2∶1)，置于圓底燒瓶中，加入65%乙醇200 mL，浸泡1 h，加熱回流1 h，減壓濃縮至100 mL，0.45 μm有機濾膜濾過，備用。

精密量取上述濃縮液2.5 mL于10 mL棕色容量瓶中，用65%的乙醇定容至刻度搖勻，制得含量為0.05 g/mL供試品，0.45 μm有機濾膜濾過，備用。

1.3.1.5 線性關系考察 取上述各濃度對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按優選出的色譜條件測定峰面積，以濃度x為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線方程。

1.3.1.6 精密度試驗 取“1.3.1.3”項下20 μg/mL的對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀中，連續進樣6次，按優選出的色譜條件測定峰面積，計算相對標準偏差RSD考察日內精密度。

1.3.1.7 穩定性試驗 取“1.3.1.3”項下20 μg/mL的對照品溶液在0、4、8、12、16、20、24 h時取10 μL注入高效液相色譜儀中，按優選出的色譜條件準確測定槲皮素的峰面積，計算相應的RSD值考察對照品穩定性。

分別在“1.3.1.4”項下供試品溶液制備后，在0、4、8、12、16、20、24 h時取10 μL注入高效液相色譜儀中，按優選出的色譜條件準確測定槲皮素的峰面積，計算相應的RSD值考察樣品穩定性。

1.3.1.8 重復性試驗 取同一批楓蓼藥材，按“1.3.1.4”項下供試品制備方法制備樣品6份，精密量取10 μL注入高效液相色譜儀中，按優選出的色譜條件測定槲皮素峰面積，計算相對標準偏差RSD考察樣品的重復性。

1.3.1.9 加樣回收率試驗 取同批次已知槲皮素含量的楓蓼粉末6份，每份約0.2 g，精密稱定，分別精密加入20 μg/mL的槲皮素標準品溶液3 mL，按“1.3.1.4”項下的方法處理供試品，精密量取10 μL注入高效液相色譜儀中，按優選出的色譜條件測定槲皮素峰面積，并測定槲皮素含量，按公式(1)計算加樣回收率。

加樣回收率=(測得值-樣品中所含成分量)/對照品加入量×100% (1)

1.3.2 藥效學試驗方法

1.3.2.1 楓蓼醇提液制備 稱取楓蓼粉末20 g，置于圓底燒瓶中，加入65%乙醇200 mL，浸泡1 h，加熱回流1 h，過濾，減壓濃縮至20 mL(1 g/mL)，備用。

1.3.2.2 熱板法 水浴鍋加滿水，使熱板接觸水面，熱板溫度控制在55±0.5 ℃。取18～22 g的雌性小鼠，放于熱板上至出現舔后足所需時間作為該鼠的痛閾值，篩選痛閾值在5～30 s的合格小鼠50只，隨機分為羅通定對照組(0.02 g/kg)、腸胃康對照組(15 g/kg)、空生理鹽水組(0.60 mL)、楓蓼醇提液高劑量組(20 g/kg)、中劑量組(10 g/kg)、低劑量組(5 g/kg)，各組小鼠分別用苦味酸標記，每天同一時間點灌胃一次，連續給藥3 d，末次灌胃后于15、30、60、90 min時間點測定痛閾值，并進行組間比較。

1.3.2.3 醋酸扭體法 取50只18～22 g SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，隨機分為生理鹽水對照組(0.60 mL)、阿司匹林對照組(0.2 g/kg)、腸胃康對照組(15 g/kg)、楓蓼醇提液高劑量組(20 g/kg)、中劑量組(10 g/kg)、低劑量組(5 g/kg)。每天同一時間點灌胃一次，連續給藥3 d，末次給藥1 h后，每只小鼠腹腔注射0.6%的醋酸溶液0.2 mL，觀察并記錄20 min內各組小鼠的扭體次數，計算鎮痛率，并進行組間比較。

陣痛率=(對照組-給藥組)/對照組×100%。

1.3.2.4 二甲苯誘發小鼠耳廓腫脹法 取50只18～22 g SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，隨機分為阿司匹林對照組(0.2 g/kg)、腸胃康對照組(15 g/kg)、生理鹽水對照組(0.60 mL)、楓蓼醇提液高劑量組(20 g/kg)、中劑量組(10 g/kg)、低劑量組(5 g/kg)。每天同一時間點灌胃一次，連續給藥3 d，最后一次灌胃60 min后，各組小鼠右耳的前后兩面均涂抹0.02 mL二甲苯，左耳不處理。120 min后處死小鼠，于相同部位在小鼠的左耳和右耳分別打下半徑為4 mm的圓狀耳片，精密稱重，計算各組小鼠耳腫脹度，并進行組間比較。

耳腫脹度(mg)=右耳重量(mg)-左耳重量(mg)

1.3.2.5 醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性影響

取50只18～22 g健康昆明小鼠，雌雄各半，隨機分為阿司匹林對照組(0.2 g/kg)、腸胃康對照組(15 g/kg)、生理鹽水對照組(0.60 mL)、楓蓼醇提液高劑量組(20 g/kg)、中劑量組(10 g/kg)、低劑量組(5 g/kg)。每天同一時間點灌胃一次，連續給藥3 d，最后一次灌胃1 h后，各鼠按體重0.1 mL/10 g迅速尾靜脈注射5%伊文思藍生理鹽水溶液，隨即每只腹腔注射 0.6%醋酸溶液0.2 mL。20 min后，脫頸處死小鼠，用6 mL生理鹽水洗滌腹腔，輕揉腹部2 min，用針管吸出腹腔洗滌液4 mL，洗滌液于3000 r/min轉速下離心15 min，取上清液。以生理鹽水為空白對照，于590 nm處用紫外分光光度法測得洗滌液吸光度A值，記錄并計算炎癥抑制率，公式如下：

炎癥抑制率(%)=(生理鹽水組吸光度-給藥組吸光度)/生理鹽水組吸光度×100%

2 結 果

2.1 槲皮素含量的測定

2.1.1 最佳檢測波長的確定 于200～400 nm波長范圍內掃描，確定370 nm為槲皮素檢測波長。

圖1 槲皮素光譜圖Fig 1 The spectrum of Quercetin

2.1.2 色譜條件 Waters Symmetry shield RP18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；流動相：A為乙腈，B為0.4%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～13 min,A為20%～45%；13～15 min，A為45%～60%；15～20 min,A為70%～20%。流速：1 mL/min;檢測波長：370 nm；柱溫：30 ℃；進樣量10 μL。槲皮素對照品色譜圖如圖2。

圖2 槲皮素色譜圖Fig 2 Quercetin chromatogram

2.1.3 線性關系考察 以濃度μg/mL為橫坐標X，峰面積Y為縱坐標，做線性回歸，得回歸方程為Y=43215X-146476，R2=0.9995，結果表明槲皮素在10～50 μg/mL濃度范圍內，線性關系良好。結果見圖3。

2.1.4 精密度考察 精密度試驗結果見表1。結果顯示槲皮素標準品溶液峰面積RSD為0.81%，表明儀器精密度良好。

圖3 槲皮素標準曲線圖Fig 3 The standard curve line

表1 精密度試驗結果Tab 1 The result of precision test

2.1.5 穩定性考察

2.1.5.1 對照品穩定性考察 對照品穩定性考察結果見表2。結果表明，對照品峰面積RSD為0.92%，表明槲皮素對照品24 h內性質穩定。

2.1.5.2 供試品穩定考察 供試品穩定性考察結果見表3。結果表明，供試品峰面積RSD為1.68%，表明供試品在24 h內性質穩定。

表2 對照品穩定性試驗結果Tab 2 The results of reference substance stability test

表3 供試品穩定性試驗結果Tab 3 The results of testing sample stability test

2.1.6 重復性考察 重復性試驗考察結果見表4。結果表明，供試品中槲皮素平均含量為353.37 μg/g，RSD為1.74%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率考察 加樣回收率考察結果見表5。結果表明，槲皮素平均回收率為99.44%，RSD為0.59%，表明該法符合試驗分析要求，準確度高。

表4 重復性試驗考察結果Tab 4 The results of repeatability test

表5 加樣回收率試驗結果Tab 5 The results of recovery test

2.2 楓蓼醇提液藥效作用

2.2.1 熱板法 熱板法觀察楓蓼醇提液鎮痛結果見表6。由表6可知，15 min時，與生理鹽水組比較，醇提液高劑量組能夠顯著延長痛閾值(P<0.05)，醇提液高劑量組與羅通定組比較，差異不具有顯著性(P>0.05)；30、60及90 min時，與生理鹽水比較，醇提液高、中、低劑量組及腸胃康組鎮痛效果均不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)；與給藥前痛閾值比較，15 min時，羅通定組、腸胃康組、醇提液高劑量組能夠顯著延長小鼠痛閾值(P<0.05)，30 min時，羅通定腸胃康組能夠顯著延長小鼠痛閾值(P<0.05)，其他各給藥組劑量組間差異均無統計學意義(P>0.05)。熱板法試驗結果表明醇提液高劑量組在給藥15 min時能有效延長小鼠痛閾值，具有鎮痛作用。

表6 楓蓼醇提液對熱刺激致小鼠疼痛反應的影響Tab 6 Effect of Fengliao alcohol extract on pain response in mice induced by heat stimulation

與給藥前痛閾值作比較1:P<0.05；同一時間點，與生理鹽水對照組比較2:P<0.05；同一時間點，與羅通定對照組作比較3:P<0.05

The pain threshold compare with before give drugs 1:P<0.05; At the same time, compare with normal saline 2:P<0.05; At the same time, compare with rotundine 3:P<0.05

2.2.2 醋酸扭體法 醋酸扭體法結果見表7。由表7可知，與生理鹽水組比較，各給藥組扭體次數均有所下降，阿司匹林陽性對照組、腸胃康對照組、楓蓼醇提液高、中劑量組均能夠顯著降低小鼠扭體次數(P<0.05)，醇提液高、中劑量鎮痛率分別為28.33%、17.41%，作用均顯著弱于阿司匹林組(P<0.05)，醇提液高劑量組鎮痛作用與腸胃康組比較無顯著性差異(P>0.05)，中劑量組差異顯著(P<0.05)。醋酸扭體法試驗結果表明，醇提液高、中劑量均能有效降低小鼠扭體次數，鎮痛作用良好，并具有一定的量效關系，醇提液高劑量組鎮痛作用與腸胃康組相當。

表7 楓蓼醇提液對小鼠扭體反應的影響Tab 7 Effect of Fengliao alcohol extract for injection on mice analgesia caused by acetic acid

與生理鹽水組作比較1:P<0.05；與阿司匹林作比較2:P<0.05；與腸胃康作比較3:P<0.05

Compare with normal saline 1:P<0.05；Compare with Acetylsalicylic acid 2:P<0.05；Compare with Chang weikang 3:P<0.05

2.2.3 二甲苯誘發小鼠耳腫脹法 二甲苯誘發小鼠耳腫脹法結果見表8。由表8可知，與生理鹽水組比較，腸胃康中藥對照組、阿司匹林西藥對照組、醇提液高劑量組均能顯著降低小鼠的耳腫脹度(P<0.05)，醇提液高劑量組腫脹抑制率約為53.09%；與阿司匹林組比較，醇提液高劑量組腫脹抑制率弱于阿司匹林組，但無統計學意義(P>0.05)；與腸胃康組比較，醇提液高劑量組腫脹抑制率高于腸胃康組，但無統計學意義(P>0.05)。二甲苯誘發小鼠耳腫脹法結果表明，醇提液高劑量組局部鎮痛效果良好。

表8 楓蓼醇提液對小鼠耳廓腫脹的影響Tab 8 Effect of Fengliao alcohol extract on anti-inflammatory of mice ear

與生理鹽水組作比較1)P<0.05；與阿司匹林作比較2)P<0.05；與腸胃康作比較3)P<0.05

Compare with normal saline 1)P<0.05；Compare with Acetylsalicylic acid 2)P<0.05；Compare with Chang weikang 3)P<0.05

2.2.4 醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響 醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響結果見表9。與生理鹽水組比較，各給藥組腹腔毛細血管滲透液吸光度均有所下降，阿司匹林陽性對照組、腸胃康對照組、楓蓼醇提液高、中劑量組下降顯著(P<0.05)，醇提液高、中劑量平均炎癥抑制率分別為37.10%、35.48%；與阿司匹林組比較，醇提液高、中劑量吸光度顯著高于阿司匹林組(P<0.05)；與腸胃康組比較，醇提液高、中劑量組吸光度無統計學差異(P>0.05)。結果表明，醇提液高、中劑量組抗炎效果良好，能夠有效抑制醋酸所致小鼠腹腔毛細血管的通透性，抑制作用弱于阿司匹林，但與腸胃康作用相當。

表9 楓蓼醇提液對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響Tab 9 Effect of Fengliao alcohol extract on the test of acetic acid on the permeability of capillary in the small intestine of rats

與生理鹽水組作比較1:P<0.05；與阿司匹5林作比較2:P<0.05；與腸胃康作比較3:P<0.05

Compare with normal saline 1:P<0.05；Compare with Acetylsalicylic acid 2:P<0.05；Compare with Chang weikang 3:P<0.05

3 討 論

槲皮素含量測定方法的建立中，流動的選擇分別考察了不同比例的有機相及不同酸度的磷酸溶液對目標峰形的影響，結果顯示采用乙腈—0.4%磷酸峰形較好，雜質峰無干擾。洗脫方式分別考察了梯度洗脫及等度洗脫方式(乙腈∶0.4%磷酸=0.48∶0.52)，結果顯示采用梯度洗脫效果較好，各極性成分能夠比較好的分離，因此選用梯度洗脫的方式。研究在建立了含量測定方法的同時，亦進行了穩定性試驗、精密度試驗、重復性試驗等一系列方法學考察，結果表明準確度高，重復性良好，可操作性強，能夠滿足質量控制的需要。

藥效試驗中，熱板法和醋酸扭體法考察的是楓蓼醇提液的鎮痛效果。熱板法為物理致痛，借助通過熱的刺激傳入神經中樞，使動物產生疼痛的感覺，使用羅通定可以抑制痛覺向中樞的傳遞，從而抑制熱刺激所引起的疼痛反應，而非甾體化合物阿司匹林作用效果較弱；醋酸扭體法為H+刺激而產生的化學疼痛，同進還會出現炎癥反應，非甾體化合物阿司匹林對這類疼痛作用較強[8-9]。故在鎮痛試驗研究中，羅通定作為熱板法西藥陽性對照藥，阿司匹林作為醋酸扭體法西藥陽性對照藥。同時選擇腸胃康作為中藥陽性對照。由熱板法試驗結果可知，醇提液高劑量組在15 min時痛閾時間顯著延長，而其他時間段皆無顯著性變化；由醋酸扭體法試驗結果可知，各劑量組均可減少扭體次數，其中醇提液高、中劑量組作用明顯。由此可知，楓蓼醇提液制劑對中樞神經鎮痛作用稍弱于外周神經的鎮痛作用。

二甲苯誘發小鼠耳腫脹法及醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性影響試驗考察的是楓蓼醇提液的抗炎效果。早期炎癥的特點包括因毛細血管通透性增加或擴張而引起的炎性滲出或腫脹[10]。在二甲苯誘發小鼠耳腫脹試驗中，120 min后生理鹽水造模組耳片腫脹明顯，與生理鹽水組比較，各組小鼠腫脹度均降低，且陽性對照組及醇提液高劑量組均有顯著性降低作用(P<0.05)，試驗表明楓蓼醇提液能顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹炎癥反應。在醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性影響的試驗中，與生理鹽水組比較各給藥組吸光度均呈下降狀態，且陽性對照組及醇提液高、中劑量組具有吸光度顯著性下降(P<0.05)。試驗表明楓蓼醇提液能有效降低早期炎性組織液的滲出，且呈現量效關系，即劑量越高，抑制率越大。

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