噬菌體Bp7耐受株K12-R生物學特性分析

陳培培，齊 心， 王 薇，任慧英，劉文華， 張 燦

(青島農業大學動物醫學院，青島 266109)

當前耐藥性細菌廣泛存在，細菌病的防治現狀形勢嚴峻[1]。噬菌體是一種專性裂解細菌的病毒，作為細菌的天敵在自然界中廣泛存在，由于其生產成本低、特異性強、不受耐藥性的影響等優點，有望作為抗生素替代品用于養殖過程中細菌病的防治[2-3]。

噬菌體裂解細菌的過程依次為吸附、注入、增殖、裝配和釋放五個階段，噬菌體吸附宿主菌表面受體是啟動噬菌體侵染過程的關鍵步驟[4]。噬菌體識別的受體種類很多，如脂多糖、膜蛋白、鞭毛等，細菌表面受體的種類決定了噬菌體能否裂解細菌[5-6]。革蘭陰性菌的脂多糖(LPS)是最常見的表面受體，作為細胞外膜的主要成分，根據其結構從內向外依次分為類脂A、核心多糖和O抗原，受多個脂多糖合成基因控制[7]。類脂A是LPS的疏水基團，決定LPS分子的內毒素活性；核心多糖與類脂A相連，可以進一步分為內核心多糖和外核心多糖區域，外核心多糖主要是己糖，根據其糖基構成可以分為五種類型，而內核心多糖主要由兩個Kdo和3個Hep(HepⅠ、HepⅡ和HepⅢ)糖基組成，保守性強，維持細胞外膜的穩定性和完整性；O抗原與外核心多糖相連，變異性強，決定細菌的抗原性及血清型[8-10]。在長期進化過程中，細菌能夠通過脂多糖合成相關基因的突變改變細胞表面脂多糖的構成，使噬菌體不能識別突變的LPS受體，進而抵御噬菌體的侵染。

筆者實驗室前期分離到一株大腸桿菌噬菌體Bp7，屬于肌尾噬菌體科T4類噬菌體，能夠裂解大腸桿菌E.coliK12[11]。在培育過程中，得到E.coliK12的突變株K12-R，能夠耐受噬菌體Bp7的裂解。為了明確K12-R的突變位點，本試驗對其基因組序列進行測序分析，并對其生物學性能進行測定，以期為明確細菌耐受噬菌體侵染的機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌野生株E.coliK12(MG1655)、突變株K12-R均由本實驗室保存。細菌基因組DNA小量純化試劑盒購自寶生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母粉和瓊脂粉購自Sigma公司。結晶紫染色液購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養及基因組序列分析 將凍存的E.coliK12和K12-R菌液分別在普通營養瓊脂板上劃線，37 ℃條件下過夜培養，挑取單菌落接種到LB液體培養基，37 ℃振蕩培養至對數期。增殖后的菌液用細菌基因組DNA小量純化試劑盒提取基因組DNA，送安諾優達基因科技有限公司進行全基因組測序，根據測序結果分析比較突變株K12-R與野生株E.coliK12在基因組上的差異。

1.2.2 菌體電鏡形態觀察 取增殖好的E.coliK12和K12-R菌液各500 μL，4 000 r·min-1離心1 min，去上清，菌體沉淀用1 mL PBS重懸，4 000 r·min-1離心1 min，去上清，重復3次。洗滌后的菌體沉淀用200 μL PBS重懸，取20 μL菌液滴加于銅網上，孵育10 min，濾紙吸去多余菌液，2% 磷鎢酸染色2 min，濾紙吸去多余染液，干燥后在日立透射電子顯微鏡HT7700下觀察。

1.2.3 生長曲線的測定 取增殖好E.coliK12和K12-R菌液，用LB調整初始菌液的濃度OD600 nm值為0.15，各取200 μL加到96孔培養板中，各設3個重復。在37 ℃的溫箱中靜止培養，每隔20 min測一次OD600 nm值，共測定5 h，根據測定結果繪制菌株的生長曲線。

1.2.4 自凝能力的測定 取E.coliK12和K12-R菌液各10 mL，10 000 r·min-1離心2 min，去上清，PBS重懸，并調整菌液的初始濃度OD600 nm為1.4，將菌液靜置于4 ℃冰箱中，每隔6 h從菌液最上層取樣200 μL，測定OD600 nm值，共檢測至54 h。

1.2.5 生物膜形成能力的測定 取E.coliK12和K12-R菌液各1 mL，用LB調整菌液初始濃度OD600 nm值為0.2，各取200 μL菌液于96孔培養板中，各設3個重復，于 37 ℃溫箱中靜置培養48 h，至其形成生物膜。棄去培養板各孔中上清，加入200 μL H2O洗去殘余上清，重復3次。培養板各孔中滴加3滴結晶紫染液，靜置20 min，使生物膜著色。棄去多余染液，加入200 μL H2O重復沖洗3次，晾干。各孔加入95%的乙醇200 μL，吹打混勻后，測定OD600 nm值。

2 結 果

2.1 E. coli K12及突變株K12-R基因組序列分析比較

提取E.coliK12及其突變株K12-R的DNA，進行基因組測序，獲得全基因組序列。與GenBank 中的E.coliK12(MG1655)基因組序列(GenBank收錄號NC_000913)進行比對，證實實驗室保存的E.coliK12野生株核苷酸序列未見有義突變。對測序得到的E.coliK12野生株基因組序列與突變株K12-R基因組序列進行比對，檢測K12-R的突變位點。比對結果顯示E.coliK12及突變株K12-R基因組序列基本一致，僅K12-R的hldE基因發生有義突變，在241—242位堿基發生缺失，導致該基因轉錄提前終止(圖1)。

圖1 K12-R突變位點分析Fig.1 Mutation sites analysis of K12-R

2.2 K12-R透射電鏡形態觀察

E.coliK12和K12-R經磷鎢酸染色處理后，透射電鏡下觀察其形態特征。E.coliK12菌體呈桿狀，細胞膜輪廓清晰可見，菌體內兩端負染。與E.coliK12比較，K12-R菌體形態沒有明顯變化，但是細胞膜輪廓不清晰，菌體內全部負染(圖2)。

圖2 E. coli K12和K12-R透射電鏡形態觀察(左10 000×，右15 000×)Fig.2 Morphology of K12 and K12-R in TEM(left 10 000×, right 15 000×)

2.3 K12-R生長曲線測定

為了檢測突變對K12-R菌體生長性能的影響，以E.coliK12為對照，進行菌液濁度測定，根據測定的OD600 nm值繪制生長曲線(圖3)。由圖可知，在最開始的40 min內細菌生長緩慢， 40～100 min大腸桿菌進入快速生長繁殖的對數期，140 min以后菌液濃度基本沒有明顯變化，細菌進入生長繁殖的平臺期。與E.coliK12比較，K12-R的生長性能明顯降低(P<0.05)。

2.4 K12-R自凝能力測定

在4 ℃靜置的條件下，測定不同時間點K12-R菌液的濁度，與E.coliK12比較，檢測hldE基因突變對K12-R自凝能力的影響，結果見圖4。由圖可知，隨著時間的推移，菌液的濁度逐漸降低，說明菌液發生自凝現象。E.coliK12菌液在24 h內濁度基本沒有變化，24 h后菌液出現自凝現象，到54 h菌液濁度維持在0.5左右，而K12-R菌液在6 h濁度即出現明顯下降，至54 h菌體基本全部形成沉淀，說明K12-R的自凝能力明顯增強(P<0.05)。

*.P<0.05圖3 E. coli K12和K12-R的生長曲線Fig.3 The growth curve of K12 and K12-R

*.P<0.05圖4 E. coli K12和K12-R的自凝能力(以濁度評價)Fig.4 The autoaggregation ability (evaluated by turbidity) of K12 and K12-R

2.5 K12-R生物膜形成能力測定

生物膜通常作為細菌應對環境變化的防御結構，對細菌的生存有積極作用。本試驗對E.coliK12和突變株K12-R生物膜形成能力進行測定比較，結果見圖5。與野生株E.coliK12比較，K12-R生物膜形成的能力明顯增強(P<0.05)。

*.P<0.05圖5 E. coli K12和K12-R生物膜形成能力Fig.5 The biofilm formation of K12 and K12-R

3 討 論

在宿主菌E.coliK12培育過程中，獲得了噬菌體Bp7的耐受株K12-R，為了明確其耐受機制，對K12-R的突變位點及其突變引起的生物學性能的改變進行了分析和測定。基因組測序比對結果表明，K12-R的hldE基因發生了2個堿基缺失，導致該基因轉錄提前終止，因此初步證實E.coliK12脂多糖是噬菌體Bp7的識別受體。

革蘭陰性菌細胞外膜是細菌抵御多種抗生素及不良環境的第一道防線，在細菌的營養吸收和廢物代謝過程中也具有重要的作用。脂多糖作為外膜的主要成分，決定細胞膜的穩定性。脂多糖成分的變化，能夠引起細菌表型的變化，如細胞膜的通透性、完整性、生物膜形成能力等[12-13]。大腸桿菌的內核心多糖由Kdo和Hep兩種糖基組成，抑制Kdo糖基合成通常導致細菌死亡，而抑制Hep糖基的合成會引起細菌表型的改變[14]。控制核心多糖生物合成的是一系列waa基因，其中hldE基因(舊稱waaE或者rfaE)編碼HepⅠ轉移酶，該基因的缺失能夠導致脂多糖內核心多糖主鏈上HepⅠ和HepⅡ之間的連接鍵發生斷裂，使細胞外膜表面的親水基團缺失，暴露出細胞膜內部的疏水基團，導致細菌表面疏水性增強[15]。本試驗中K12-R突變株的hldE基因轉錄提前終止，引起細胞生物學性能一系列的變化。由于細胞外膜疏水性增強，導致K12-R突變株的自凝能力明顯增強，這與之前報道一致[10, 12]。電鏡觀察突變株K12-R形態發現其細胞內全部負染，說明磷鎢酸染液能夠順利進入細胞內部，證明hldE基因缺失使細胞膜通透性增加，甚至影響細胞膜的完整性。R. Nakao等[10]報道了hldE基因缺失并不影響菌體的生長性能，Z. Wang等[12]報道了敲除核心多糖各合成基因后，各突變株生長性能普遍增強，認為其生長狀態的改變與外核心多糖的半乳糖糖基相關。但是本試驗中生長曲線測定結果顯示K12-R的生長性能明顯降低，推測其原因是由于hldE基因突變影響了菌體細胞膜的完整性，進而影響了細菌生長狀態。細菌的黏附能力是影響生物膜形成的重要因素，據報道，LPS能夠促使細菌黏附在適宜的介質表面，形成生物膜[16]。大腸桿菌核心多糖的構成與大腸桿菌生物膜的形成密切相關[10]。前期研究表明，在多種革蘭陰性菌中，核心多糖的缺失均能夠促進生物膜的形成[10, 17-18]。本試驗中hldE基因突變也同樣導致K12-R的生物膜形成能力顯著增強，這說明在革蘭陰性菌中，其脂多糖成分的缺失能夠增強細菌生物膜形成能力可能是一個普遍現象，因為脂多糖的缺失暴露了內部的疏水性基團，提高了細胞膜表面的疏水性，促進了生物膜的生成[19]。

細菌在長期進化過程中，通過多種耐受機制抵御噬菌體的侵染。本研究證實K12-R通過hldE基因突變，耐受了噬菌體Bp7的侵染，初步證實噬菌體Bp7通過識別宿主菌E.coliK12表面的脂多糖受體侵染細菌，后續將進一步驗證E.coliK12的內核心多糖與噬菌體Bp7的相互作用，這將為進一步闡明細菌耐受噬菌體侵染機制提供理論依據。

4 結 論

E.coliK12的脂多糖合成基因hldE突變能夠改變K12-R脂多糖的結構，從而抑制噬菌體Bp7的吸附。突變株K12-R細胞膜通透性增加，生長繁殖能力降低，自凝能力增強，生物膜形成能力增強。

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