槲皮素對大鼠肝和空腸P-糖蛋白表達及外排功能的影響

何 方，Bhutto Zohaib，郭 荔，王麗平

(南京農業大學動物醫學院，南京 210095)

P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是ATP結合轉運家族(ATP-binding cassette transporter)的重要成員，含有12個跨膜區，每6個形成1個疏水性跨膜域，另外還含有2個細胞質內核苷酸結合域，可借助ATP水解提供的能量將外源化合物泵出胞外[1]。P-gp不僅可以介導腫瘤細胞的耐藥性，而且在人和動物的肝、腎和小腸等組織中均有表達，分布廣泛，限制了外源化合物的吸收和體內分布[2]。因其對部分藥物的體內過程產生作用，可導致藥物的生物利用度發生變化或介導藥物間的相互作用，故近年來引起了眾多藥劑學研究者的關注，相關研究也已成為該領域的熱點[3]。P-gp的表達和功能可受眾多外源化合物的影響，如L. Jetté等[4]研究發現SDZ-PSC 833 (PSC)可以通過改變藥物結合位點的方式消除環孢霉素A和維拉帕米對小鼠組織P-gp功能的影響。T. Chen 等[5]在乳腺癌MCF-7細胞的研究上發現，達沙替尼可以通過抑制ERK信號通路，下調P-gp表達，從而達到逆轉多藥耐藥的效果。近年來還有些結果顯示一些中草藥或植物成分對P-gp的表達和功能也有顯著影響。如薩礎拉等[6]采用大鼠外翻腸囊模型研究了三七皂苷有效組分中人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1，發現其具有明顯的P-gp底物轉運特性并可競爭性抑制P-gp底物外排。安息香醛、香草醛和β-細辛醚對P-gp的外排功能有明顯抑制作用，可顯著促進Caco-2細胞對Rho-123的攝取[7]。

槲皮素，又名櫟精，廣泛存在于眾多植物的花、葉和果實中，是一種具有生物活性的多羥基黃酮類化合物[8]。研究顯示槲皮素具有較多的生物功能，不僅具有抗腫瘤活性[9]，還具有防輻射、保護心血管[10]和抗病毒[11-12]等直接作用。尤其近年來一系列的試驗證實槲皮素對腫瘤細胞P-gp的表達和功能產生影響，如鐘華等[13]證實較高濃度的槲皮素(100 μmol·L-1)可下調K562/A02細胞mdr1基因的表達從而逆轉腫瘤細胞的耐藥性。單保恩等[14]的研究顯示槲皮素能通過下調腫瘤細胞多藥耐藥基因mdr1及其編碼蛋白P-gp的表達，增加人子宮內膜癌耐藥細胞B-MD-C1(ADR+/+)內ADM的濃度，從而達到逆轉耐藥的效果。但也有研究結果顯示低劑量的槲皮素可顯著誘導P-gp的表達從而影響P-gp底物藥物的體內過程[15]上述體外細胞研究結果提示槲皮素可以影響P-gp的表達和功能，但是與處理劑量相關，表現出雙相作用。自然界多種植物中均含有槲皮素，故當植物性飼料用于動物時，是否會對動物的代謝和吸收器官(肝和小腸)中的P-gp產生作用從而影響P-gp底物藥物的生物利用度或介導藥物間相互作用的發生尚不清楚?；诖?，本試驗首先以實驗動物大鼠為研究模型，通過體內實驗初步探討槲皮素對動物組織中P-gp表達和功能的影響，進一步挖掘其介導藥物間相互作用的理論基礎，該研究結果可為獸醫臨床合理用藥提供指導。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥物

RNAisoTMPlus，Prime ScriptTMKit，SYBR Premix(TaKaRa)；乙腈(TEDIA，色譜純)、三乙胺(Enox，分析純)，伊維菌素(SIGMA)，槲皮素(上海紫一試劑廠， ZY140216)，ATPase試劑盒(南京建成A070-1)，ATP含量測定試劑盒(碧云天，S0026)。Kreb-Ringer′s灌流液制備：7.8 g NaCl，0.35 g KCl，1.37 g NaHCO3，0.02 g MgCl2，0.22 g NaH2PO4和1.48 g葡萄糖溶解1 000 mL三蒸水中，用1 mol·L-1HCl 或NaOH 調節pH至6.5。伊維菌素腸道灌流液：用Kreb-Ringer′s配制濃度5 μg·mL-1進行灌流。

1.2 細胞及其處理分組

Caco-2 細胞株購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，培養條件為 37 ℃，5% CO2，95% 濕度，于本實驗室傳代培養保存。

Caco-2細胞復蘇，經傳代培養長至致密單層時，分為對照組和處理組共7組。其中處理組細胞分為用低濃度槲皮素(5 μmol·L-1)和高濃度槲皮素(25 μmol·L-1)分別處理6、12和24 h。于各時間點收集樣品后用于后續ATPase活性分析。

1.3 實驗動物和分組

清潔級雄性SD大鼠，40日齡，體重(280±20)g，購自江蘇南京青龍山動物養殖基地，適應飼養7 d后用于試驗。動物分組及處理見表1。

表1 動物分組與處理方法

Table 1 The groups and treatment of the animals in this study

組別Group動物數/只Animalnumber處理Treatment生理鹽水對照組Normalsalinegroup6早、晚兩次灌服,連續15d15mg·kg-1槲皮素處理組115mg·kg-1quercetintreatmentgroup16早、晚兩次灌服,連續5d15mg·kg-1槲皮素處理組215mg·kg-1quercetintreatmentgroup26早、晚兩次灌服,連續15d60mg·kg-1槲皮素處理組160mg·kg-1quercetintreatmentgroup16早、晚兩次灌服,連續5d60mg·kg-1槲皮素處理組260mg·kg-1quercetintreatmentgroup26早、晚兩次灌服,連續15d

1.4 槲皮素處理對大鼠肝和空腸mdr1、PXR和CAR mRNA及P-gp表達的影響

1.4.1 Real-time RT-PCR檢測大鼠空腸和肝中mdr1a、mdr1b、PXR和CARmRNA表達量 槲皮素處理組大鼠分別處理5和15 d后斷頭處死。取空腸和肝組織置于-80 ℃保存。取100 mg組織用組織破碎儀進行破碎，按照說明書用Trizol法提取組織總RNA。測定樣品OD260 nm/OD280 nm比值，確定RNA的濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。用反轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA于-20 ℃保存備用。利用premier 5.0軟件設計大鼠mdr1a、mdr1b、PXR、CAR和看家基因Gapdh引物序列(由上海捷瑞生物公司合成)。參照SYBR Premix ExTaqTM說明書，實時熒光定量PCR檢測上述基因mRNA轉錄水平。結果采用相對定量分析，用ΔCt法計算基因的相對表達量。引物序列見表2。

表2 熒光定量 PCR基因引物序列

Table 2 Primers used in real-time RT-PCR

基因Gene引物(5'-3')Primer引物(3'-5')Primermdr1aAGGCAATGGCAACATTTTTTGGTGGGATAAGCAGAAAAGCTGCACCCATGmdr1bAGTCCATAACGACATTTTCAGCCGGGACCAACAGGTAGGCAATACCTATGGapdhCAGTATGATTCTACCCACGGCAGATCCACAACGGATACATCARCAGCCTGCAGGTTGCAGAAGTTCCACAGCCGCTCCCTTGAPXRTCCACTGCATGCTGAAGAAGAACCTGTGTGCAGGATAGGG

1.4.2 Western blot法檢測肝和空腸P-gp蛋白表達水平 取100 mg肝和空腸組織剪碎，加入RIPA裂解液，用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見組織塊。4 ℃，10 000 r·min-1條件下離心15 min。將上清吸入另一預冷的干凈離心管，得到組織總蛋白。用BCA法測定蛋白質含量，加入Loading Buffer煮沸5 min，得到蛋白質樣品并保存。按照不同蛋白質濃度上樣，進行SDS-PAGE電泳，半干轉印儀轉印至PVDF膜上，室溫封閉2 h，4 ℃ 一抗孵育過夜，然后室溫二抗孵育1 h，曝光。Image J軟件分析蛋白質表達量。

1.4.3 SABC免疫組織化學方法檢測肝和空腸P-gp的定位和蛋白質表達 各組大鼠處死后迅速采集肝和空腸組織。用生理鹽水沖洗血液及腸道內容物后，放入4%多聚甲醛中固定超過48 h。常規制備5 μm厚石蠟切片(載玻片預先用APES 處理)，37 ℃恒溫箱中過夜烘干，冰箱中保存。按照試劑盒步驟進行SABC免疫組織化學方法染色，將切片常規脫蠟至水，用3% H2O2于室溫作用15 min，進行抗原熱修復后用5% BSA封閉。用稀釋過的P-gp抗體于4 ℃孵育過夜，用PBS洗滌，二抗繼續孵育45 min，用PBS洗滌干凈。滴加SABC 于37 ℃作用30 min 后進行DAB顯色，用蘇木素輕度復染。保存切片并用顯微鏡進行拍照。

1.5 槲皮素對伊維菌素的大鼠空腸滲透性的影響

1.5.1 大鼠空腸單向在體灌流模型的建立 參考I. Lozoya-Agullo等[16]的質量差法略作修改，建立大鼠空腸單向在體灌流方法。對照組和槲皮素預處理15 d組的大鼠，腹腔注射40%的烏拉坦溶液(0.5 mL·kg-1，按體重給藥)進行麻醉。待大鼠麻醉后將其固定于手術臺上。于左側后腹部打開腹腔2～3 cm，精確量取10 cm空腸腸段作為灌流腸段。沿空腸腸生理蠕動方向插入并結扎供液和收液灌流管。用K-R緩沖液(37 ℃)以0.2 mL·min-1沖洗腸段約30 min后，更換含有伊維菌素的K-R灌流液平衡30 min。平衡后，每隔15 min更換一次已知質量的供液管和集液管，試驗持續時間為105 min。最后，將大鼠處死，剪下灌流腸段，測量其長度和內徑，同時精確稱量供液瓶和集液管的質量，迅速將收集的灌流樣品于-20 ℃保存至待測。

1.5.2 樣品處理 將樣品在4 ℃融化，渦旋混勻，取200 μL 12 000 r·min-1離心20 min過濾后，取100 μL上清加入樣品瓶中待測。

1.5.3 伊維菌素HPLC方法建立 參考《中華人民共和國獸藥典》2010版[17]方法，采用高壓液相方法測定伊維菌素濃度。色譜條件如下，色譜柱：XDB-C18柱(5 μm，25 cm × 4.6 mm，Agilent)；檢測波長：紫外檢測 254 nm；流動相：V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=50∶41∶9；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

1.5.4 伊維菌素標準曲線、檢測限和定量限的測定 將空白K-R灌流液12 000 r·min-1，離心20 min后，取上清。配制濃度為2、2.5、5、10、12.5、20、25、50、100 μg·mL-1的伊維菌素標準溶液，每個濃度設有5個平行重復。以伊維菌素濃度(X)對峰面積(Y)計算，得標準曲線及回歸方程。以信噪比S/N>3時伊維菌素的濃度為檢測限，以信噪比S/N>10時伊維菌素的濃度為定量限。

1.5.5 計算伊維菌素吸收速率常數(Ka)和藥物表觀滲透系數(Papp)Ka和Papp分別采用下述公式進行計算：

式中Qin和Qout分別為空腸進出口灌流液的體積(mL)；Cin和Cout分別為空腸進出口灌流液的質量濃度(μg·mL-1)；Q為灌流速度(0.2 mL·min-1)；V為灌流腸段的容積；r和l分別為腸段的半徑和長度(cm)；計算藥物Ka和Papp。

1.6 槲皮素對 Caco-2細胞ATPase活性的影響

按“1.2”中所示方法處理細胞后，用預冷的PBS洗3遍。用細胞刮直接將細胞刮下，然后細胞懸液冰水浴超聲破碎：功率300 W，3～5 s·次-1，間隔30 s，重復3～5次。取制備好的勻漿液按照ATPase試劑盒(南京建成)說明書測定蛋白質濃度和ATP酶活性。

1.7 數據處理與統計

2 結 果

2.1 槲皮素對大鼠組織mdr1a、mdr1b、PXR和CAR mRNA表達量的影響

2.1.1 槲皮素對大鼠肝組織mdr1a、mdr1b、PXR和CARmRNA表達量影響 結果如圖1所示。大鼠經60 mg·kg-1槲皮素處理5和15 d后，肝中mdr1a和mdr1b mRNA表達量較對照組顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高；經15 mg·kg-1的槲皮素處理15 d后，mdr1a和mdr1b mRNA表達量極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)升高，但處理5 d時mdr1a和mdr1b mRNA表達量均未見顯著變化(P>0.05)。槲皮素處理大鼠的PXRmRNA表達量比對照組顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高，高劑量槲皮素長時間處理后，CARmRNA表達量較對照組變化則更為顯著。經相關性分析，肝mdr1a、mdr1b和CARmRNA表達量之間存在顯著的相關性(P<0.05)。

與對照組比較，*. P<0.05; **.P<0.01Compared with control，*. P<0.05; **. P<0.01圖1 槲皮素對大鼠肝組織mdr1a、mdr1b、PXR和CAR mRNA表達量影響Fig.1 mdr1a，mdr1b，PXR and CAR mRNA expression in rats liver after treated by quercetin

2.1.2 槲皮素對大鼠空腸組織mdr1a、mdr1b、PXR和CARmRNA表達量影響 60 mg·kg-1槲皮素預處理大鼠，空腸組織的mdr1a、mdr1b和CARmRNA表達量均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高。而當槲皮素處理濃度高達60 mg·kg-1處理15 d后，空腸中PXRmRNA表達量才會顯著上升(P<0.05)。經相關性分析，空腸mdr1a、mdr1b和CARmRNA表達量之間存在顯著的相關性(P<0.05)。結果如圖2所示。

2.2 槲皮素對大鼠肝和空腸組織P-gp蛋白表達量影響

上述結果顯示60 mg·kg-1的槲皮素對各基因的mRNA表達量影響較大，故研究蛋白質水平變化時采用該劑量進行分析。結果表明槲皮素處理大鼠5 d后，肝和空腸P-gp蛋白表達量就會顯著上升(P<0.05)，處理時間延長至15 d時，肝和空腸P-gp蛋白表達量極顯著上升(P<0.01)。蛋白質水平的變化與上述mRNA水平變化一致。結果見圖3。

2.3 槲皮素對P-gp在大鼠肝和空腸中定位的影響

免疫組化結果顯示，槲皮素處理并未改變P-gp 在肝和空腸中的定位，但對其蛋白的表達量產生顯著影響。如圖4A～C所示，P-gp在肝主要定位于肝細胞間的膽小管膜上；如圖4D～F所示，在大鼠空腸主要分布于小腸絨毛上皮細胞頂端和小腸腺靠近腔面細胞的頂端。

用Imagepro-plus 軟件，以Area 和IOD作為衡量表達量的指標，對對照組和槲皮素處理組的肝和空腸P-gp表達量進行半定量分析。結果如圖4G、H所示。與對照組相比，15 mg·kg-1槲皮素處理大鼠15 d后，可極顯著增加肝中P-gp的表達量(P<0.01)，且作用強于高劑量的槲皮素；60 mg·kg-1槲皮素處理組可極顯著增加P-gp在空腸的表達量(P<0.01)，作用較15 mg·kg-1的槲皮素更強，結果與肝存在一定差異?？傮w來講，免疫組化方法檢測的肝和空腸組織中P-gp表達變化與Western blot的結果相一致，再次證實一定劑量的槲皮素可誘導P-gp的表達。

與對照組比較，*. P<0.05; **.P<0.01Compared with control，*. P<0.05; **. P<0.01圖2 槲皮素對大鼠空腸組織mdr1a、mdr1b、PXR和CAR mRNA表達量影響Fig.2 mdr1a，mdr1b，PXR and CAR mRNA expression in rats jejunum after treated by quercetin

與對照組比較，*. P<0.05; **.P<0.01Compared with control，*. P<0.05; **. P<0.01圖3 60 mg·mL-1槲皮素對大鼠肝和空腸組織P-gp蛋白表達量影響Fig.3 P-gp expression in rat liver and jejunum after treated by 60 mg·mL-1 quercetin

2.4 槲皮素對伊維菌素在大鼠小腸滲透性的影響

2.4.1 伊維菌素的色譜行為和標準曲線 采用上述方法中色譜條件，測定空白K-R灌流液，在0～20 min內基線平穩且無干擾峰出現，添加20 μg·mL-1伊維菌素后，可檢測到目標峰，峰形良好，無干擾峰，平均保留時間約為16.18 min。以峰面積(A)對藥物濃度(C, μg·mL-1)進行線性回歸，得到伊維菌素的線性回歸方程：y= 0.357 3x+ 0.128 9。在該檢測條件下，濃度與峰面積線性關系良好，R2=0.999。檢測限為2 μg·mL-1，定量限為2.5 μg·mL-1。

2.4.2 大鼠空腸中伊維菌素濃度變化 取經60 mg·kg-1槲皮素處理15 d的大鼠進行空腸單向在體灌流試驗。結果可見處理組收集液中伊維菌素濃度較對照組有增加趨勢，如圖5所示。伊維菌素的吸收速率常數(Ka)和表觀滲透系數(Papp)見表3。與空白對照組相比，伊維菌素的Ka未發生顯著變化(P>0.05)，但Papp顯著下降(P<0.05)。

A. 對照組大鼠肝；B. 15 mg·kg-1 槲皮素處理組大鼠肝；C. 60 mg·kg-1槲皮素處理組大鼠肝；D. 對照組大鼠空腸；E. 15 mg·kg-1槲皮素處理組大鼠空腸；F. 60 mg·kg-1槲皮素處理組大鼠空腸；G、H. 大鼠肝和空腸組織中P-gp的半定量分析。與對照組比較，*. P<0.05; **. P<0.01A. Liver of control rats；B. Liver of rats treated by 15 mg·kg-1 quercetin；C. Liver of rats treated by 60 mg·kg-1 quercetin; D. Jejunum of control rats；E. Jejunum of rats treated by 15 mg·kg-1 quercetin；F. Jejunum of rats treated by 60 mg·kg-1 quercetin; G and H. Semi-quantification of P-gp in rats liver and jejunum, respectively. Compared with control，*. P<0.05; **. P<0.01 圖4 大鼠肝和空腸中P-gp的定位及表達量分析Fig.4 Immunohistochemical staining for P-gp in the rats liver and jejunum

圖5 大鼠空腸灌流液中伊維菌素的濃度變化曲線Fig.5 Effect of quercetin on ivermectin concentration in rats jejunum

參數Parameters對照組Control槲皮素組(60mg·kg-1,15d)Quercetingroup吸收速率常數/(min-1)Ka0.0294±0.02560.0233±0.0256表觀滲透系數/(cm·min-1)Papp0.0275±0.04400.0184±0.0680*

與對照組相比，*.P<0.05差異顯著

Compared with control，*.P<0.05

2.5 槲皮素對Caco-2細胞ATP酶活性的影響

按“1.2”中所述方法對Caco-2細胞進行預處理，檢測槲皮素對Caco-2細胞ATP酶活性的影響。結果如圖6所示，不同濃度的槲皮素處理6、12和24 h 后均可極顯著增加Caco-2細胞的ATP酶活性(P<0.01)，且存在一定的劑量依賴性。

**. P<0.01圖6 槲皮素對Caco-2細胞ATP酶活性影響Fig.6 Effect of quercetin on Caco-2 ATPase

3 討 論

槲皮素是一種來源廣泛的黃酮類化合物，常被用于食品中的抗氧化劑。研究顯示，槲皮素具有免疫調節、抗炎、抗氧化的作用[18-19]。對MCF-7細胞的研究發現，槲皮素還具有阻滯細胞周期的作用，并可通過線粒體通路激活caspase級聯反應，誘導MCF-7細胞凋亡等[20]。有研究顯示槲皮素可以通過誘導凋亡而抑制HepG2細胞生長，若通過抑制MDR1 mRNA的表達而抑制P-gp的表達，可以提高細胞內抗癌藥物濃度，改善化療療效[21]。但有研究稱槲皮素對P-gp的調節有雙向作用，表現為高劑量抑制作用，而低劑量為誘導作用，可能與其不同的作用位點、底物及濃度有關[22]。但上述研究僅限于體外細胞，且主要探討其在腫瘤細胞耐藥方面的作用及其機制，未涉及其在口服藥物吸收和藥物間相互作用方面的影響。因槲皮素在植物中存在廣泛，故植物源性飼料中存在的槲皮素若長期給予動物后是否會引起動物不同組織中P-gp的表達和功能發生變化，并進一步影響到口服藥物的吸收和藥物間相互作用發生，仍未進行系統研究。故本試驗首先以實驗動物大鼠為研究對象，初步探討了槲皮素對大鼠肝和空腸中P-gp表達和功能的影響，為臨床合理用藥提高口服藥物的生物利用度和避免藥物間相互作用提供一定參考，并為后續在養殖動物中開展相關研究奠定基礎，故具有較好的理論和臨床實踐指導意義。

嚙齒動物中，P-糖蛋白由mdr1的兩個亞型mdr1a和mdr1b編碼[23]。核受體——孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)和組成型雄甾烷受體(constitutive androstane receptor，CAR)是調節P-gp表達的重要因子[24-25]。研究表明mdr1的啟動子上含有DR4/ER6應答元件，可以被PXR/RXR二聚體識別結合，從而調控mdr1基因的表達[26-27]。還有研究顯示與PXR類似的CAR也可與mdr1基因增強子上不同核受體反應元件相結合進而激活mdr1的轉錄，而外源性化合物即可通過激活PXR或CAR通路調控mdr1的轉錄[28]。本研究采用real-time RT-PCR、免疫組化和Western blot方法證實槲皮素會導致大鼠肝和空腸P-gp在mRNA和蛋白質水平均發生顯著上調的現象，并且其在mRNA水平的變化與CARmRNA的上調表達存在較為顯著的相關作用，佐證了前人的研究結果，即外源性化合物可以通過激活核受體調控mdr1的表達。但因本試驗中未篩選到有效的CAR和PXR抗體，故對大鼠肝和空腸中PXR和CAR蛋白表達水平未能進行檢測。后續研究中，將繼續選擇有效抗體或利用PXR和CAR抑制劑在此方面進行深入研究。

P-gp蛋白為ATP依賴性外排蛋白，其外排功能的實現依賴于ATP水解提供的能量，所以本試驗又進一步探究了槲皮素對ATP酶活性的影響。本試驗初期擬檢測槲皮素對大鼠腸組織中ATP酶活性的影響，但在測定中發現體內影響因素較多，未能取得較好的試驗結果，而Caco-2細胞來源于人結腸癌上皮細胞，體外培養條件下，能分化形成致密的單分子細胞層，與小腸上皮的結構和生化作用相似，不僅具有微絨毛結構，還能表達多種蛋白載體和酶，也是FDA推薦用于研究P-gp外排功能及藥物跨膜轉運的優秀細胞之一[29]，故本試驗選擇了Caco-2細胞研究了槲皮素對其ATP酶活性的影響。結果也顯示不同濃度的槲皮素處理Caco-2細胞后，ATP酶活性均極顯著升高，由此提示槲皮素不僅可通過增加P-gp的表達，而且可通過提高ATP酶活性促進ATP水解提供更多能量來協同增加P-gp對底物的外排功能，該現象也會通過動物體內試驗進一步驗證。

槲皮素可增加大鼠空腸P-gp的表達，但P-gp的外排功能是否也隨表達量增加而增強？為證實該假設，本研究又進一步采用大鼠空腸單向在體灌流方法驗證槲皮素處理大鼠對P-gp底物藥物滲透性的影響。已有研究顯示伊維菌素為P-gp的底物，如J. Griffin等[29]證實伊維菌素是人和犬P-gp的底物，M. B. Molento等[30]發現當伊維菌素與P-gp抑制劑維拉帕米聯合用藥后，伊維菌素在山羊體內的峰濃度Cmax顯著升高。故本試驗選用伊維菌素作為P-gp底物進行試驗，結果顯示伊維菌素在空腸的Papp顯著下降，與槲皮素顯著增加空腸P-gp表達的結果非常一致，因此證實一定劑量的槲皮素不僅可增加P-gp的表達水平，同時可增加其外排功能。

4 結 論

采用real-time RT-PCR、免疫組化和Western blot方法證實槲皮素會導致大鼠肝和空腸P-gp在mRNA和蛋白質水平均顯著上調，并且其在mRNA水平的變化與CARmRNA的上調表達存在顯著的相關作用。槲皮素處理Caco-2細胞后，ATP酶活性均極顯著升高，單向在體腸灌流試驗表明槲皮素處理大鼠對伊維菌素的腸滲透性顯著降低，提示槲皮素可通過提高ATP酶活性促進ATP水解提供更多能量來協同增加P-gp對底物的外排功能。

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