山西省野生麗豆的DNA條形碼物種鑒定

謝 勇，王 洋，李佩萍，馮 斌，范玉喜，王長青，徐東明

(1.中國醫學科學院藥用植物研究所，中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193；2.晉中市林業局，山西 晉中 030600；3.晉中市榆次區林業局，山西 晉中 030600)

麗豆(Calophaca)為蝶形花科、麗豆屬灌木或小灌木植物，《中國植物志》記載我國境內的麗豆有3種：麗豆(CalophacasinicaRehd)、華麗豆(CalophacachinensisBoriss)和新疆麗豆(CalophacasoongoricaKar. et Kir)。華麗豆和新疆麗豆分布于新疆西部，麗豆分布于山西省和內蒙古自治區。麗豆具有深根性、耐旱、耐寒、耐瘠薄等優點，有較強的水土保持功能，在生態環境改良方面有很好的應用前景。

我國境內天然分布的麗豆屬植物十分稀少，華麗豆和新疆麗豆已被列入珍稀瀕危植物保護名錄。山西省內麗豆天然分布于太原市龍山、天龍山、古交，晉中市烏金山，呂梁市交城、離石等地海拔900 m～1 700 m的山谷陰處或山坡草地、灌叢中。麗豆天然分布區域狹小，加之部分地區為旅游風景區，人為干擾因素多，造成種群數量稀少，也呈現極度瀕危之勢。

瀕危物種的保護和利用是保護生物多樣性和資源可持續開發最重要的任務之一。其中，至關重要的步驟就是正確鑒定和區分物種。DNA條形碼物種鑒定技術是近期發展起來的基于DNA分子序列的物種鑒定技術。植物物種的DNA條形碼物種鑒定體系是基于核糖體DNA第二內部轉錄間隔區(ITS2)主體條形碼序列，以葉綠體psbA-trnH為輔助序列建立的，該技術可以避免傳統形態學鑒定中主觀因素的干擾等。為了確保麗豆的引種基源，筆者對太原天龍山、晉中烏金山、甘肅慶城采集到麗豆進行了基于DNA條形碼的物種鑒定研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

麗豆干種子，采于甘肅慶城、晉中烏金山和太原天龍山。

1.1.2 儀器

伯樂產核酸電泳儀，湘儀產高速離心機，杭州奧盛儀器有限公司產恒溫恒濕培養箱，上海越平科學儀器有限公司產電子天平(量程0.1 mg～100.0 mg)，美國產Abi prism 310型DNA測序儀，MG384型PCR擴增儀。

1.1.3 試劑

Genstar公司產DNA提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒，全式金生物技術公司產DNA擴增試劑2×supermix，北京化工廠產分析純試劑三氯甲烷、無水乙醇、正丁醇和異戊醇，雙蒸水由本實驗室制備。DNA擴增引物，由北京擎科生物科技有限公司合成，序列如下：

IS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，

IS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′，

psbAF：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′，

trnHR：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′.

1.2 方法

1.2.1 麗豆DNA的提取

干種子內無葉綠體存在，為了保證psbA-trnH條形碼DNA被順利擴增，將每種產地的麗豆種子隨機抽取20粒，用水浸泡置于恒溫恒濕培養箱內，設定溫度25 ℃，相對濕度70%，待胚根和胚葉萌出后改種土壤中。室溫下培育，待植株長成后取葉片提取總DNA.從每種產地麗豆的植株上隨機采取鮮嫩葉片約5 g，加入液氮充分磨碎，之后稱取100 mg麗豆葉片粉末于1.5 mL離心管中，待溫度回升至室溫后按照DNA提取試劑盒操作流程提取DNA.具體操作如下：加入600 μL DNA提取液于離心管中，輕微搖晃，使樣品散開。65 ℃恒溫30 min，使DNA盡可能游離，加入300 μL三氯甲烷∶異戊醇(24∶1)溶液，震蕩10 s，10 000 g離心10 min，取上清液。按體積比1∶1加入預冷的無水乙醇，-20 ℃恒溫20 mim.13 000 g離心10 min，棄上清液。加入500 μL 70%的乙醇，13 000 g離心5 min，棄上清液。在37 ℃恒溫箱內使乙醇充分揮發，加入40 μL PB溶液，分裝于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 PCR擴增

以提取的DNA為PCR擴增實驗模板，分別擴增ITS2和psbA-trnH條形碼DNA.擴增反應配方如下：DNA溶液1 μL，正反引物各1 μL，2×supermix 12.5 μL，用雙蒸水9.5 μL制備成25 μL的反應體系。

ITS2的擴增條件：① 94 ℃ 5 min；② 94 ℃ 30 s；③ 56 ℃ 30 s；④ 72 ℃ 45 s；⑤ 72 ℃ 10 min；④→② 步實施35個循環。

psbA-trnH擴增條件：① 94 ℃ 5 min；② 94 ℃ 1 min；③ 55 ℃ 1 min；④ 72 ℃ 1 min；⑤ 72 ℃ 7 min；④→② 步實施40個循環。

1.2.3 DNA回收和堿基序列測試

PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增片段分子量時加入DL5000 DNA Maker為對照，100 V恒定電壓下實施電泳40 min，凝膠成像系統觀察并拍照。在紫外燈下快速切膠，從膠塊回收DNA片段的操作按照DNA片段回收試劑盒所述規程進行。獲得條形碼DNA后使用Abi prism 310型DNA測序儀，以PCR擴增引物作為測序引物，依照Sanger測序法對獲得的每種來源的麗豆的ITS2和psbA-trnH進行雙向測序。獲得的堿基序列信息拼裝后用BLAST軟件對比測定DNA序列。

2 結果分析

2.1 條形碼DNA的擴增結果

送檢樣品中，甘肅慶城麗豆萌發率為35%，太原天龍山麗豆萌發率為16%，晉中烏金山麗豆萌發率為5%.總的來看，這些產地的麗豆自然萌發率均較低。以3種麗豆植株葉提取的DNA為模板，PCR擴增ITS2和psbA-trnH的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分析結果如第23頁圖1所示。

圖1 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

由圖1可以看出，psbA-trnH和ITS2片段含有的堿基數約400 bp.從獲得的結果來看，每種樣品中的psbA-trnH和ITS2擴增成功。

2.2 3種產地麗豆的ITS2和psbA-trnH堿基序列

將每種樣品的條形碼DNA切膠回收后，用擴增引物實施雙向測序，獲得每種產地麗豆的ITS2和psbA-trnH的5’→3’序列和3’→5’序列。將每種條形碼DNA的5’→3’序列和3’→5’序列進行拼裝，去除兩端的引物序列，得到3種不同產地麗豆的條形碼DNA序列。用BLAST軟件對比測定每種產地麗豆的ITS2序列和psbA-trnH序列，確定是否存在序列差異。Esprit軟件展示的序列對比結果如圖2，圖3所示。

圖2 Esprit軟件展示的ITS2堿基序列對比

圖3 Esprit軟件展示的psbA-trnH堿基序列對比

由圖2，圖3可以看出，甘肅慶城(Q)、太原天龍山(T)和晉中烏金山(W)麗豆的ITS2序列和psbA-trnH序列完全相同。可以證明這3種產地的麗豆是同一物種。DNA序列測試數據也顯示無外源性DNA污染。3種麗豆的ITS2序列和psbA-trnH序列如表1所示，可以作為基于DNA條形碼技術的麗豆物種鑒定的參照系。

將表1中的ITS2序列與美國NCBI的DNA序列數據庫進行對比，結果見第24頁圖4.將表1中psbA-trnH序列與美國NCBI的DNA序列數據庫進行對比，結果見第24頁圖5.

由圖4，圖5可以看出，山西麗豆的ITS2序列和麗豆種Caragana_densa的ITS2序列(Sequence ID:KF530297.1)相似度最大，達99%.山西麗豆psbA-trnH序列與麗豆種Caragana_korshinskii(Sequence ID:KX289923.1)，麗豆種Caragana_microphylla來源的psbA-trnH序列(Sequence ID:KX289922.1)相似度大于98%.因此，表1中的ITS2序列和psbA-trnH

表1 3種產地麗豆ITS2序列和psbA-trnH序列

序列是已登錄麗豆種以外物種的DNA條形碼序列。根據《中國植物志》記載的山西麗豆植物分類學物種為CalophacasinicaRehd，本項研究測定的ITS2序列和psbA-trnH序列是CalophacasinicaRehd的DNA條形碼序列。

圖4 麗豆ITS2序列與美國NCBI DNA序列數據庫對比

圖5 麗豆psbA-trnH序列與美國NCBI DNA序列數據庫對比

3 討論

DNA條形碼是指生物體內能夠代表該物種的，標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段，測定既有物種的DNA條形碼序列可以建立數據庫和鑒定平臺，通過生物信息學分析方法比對DNA序列數據，從而實現物種的精準鑒定。其前提是要有已經被精準鑒定的物種DNA條形碼作為對照，才能獲得準確的鑒定結果。我國分布于新疆的麗豆來源ITS2序列和psbA-trnH序列已被測定，而山西省和內蒙古自治區的麗豆沒有進行ITS2序列和psbA-trnH序列測定建立鑒定平臺。山西野生麗豆的植物分類學物種為CalophacasinicaRehd，是傳統植物物種鑒定的結論，從植株、種子等外形來看，作為鑒定樣本的麗豆物種應為CalophacasinicaRehd，可以認為本項研究測定的ITS2序列和psbA-trnH序列可以作為基于DNA條形碼技術鑒定物種是否為CalophacasinicaRehd的對照序列，補充了中國天然分布麗豆的DNA條形碼物種鑒定的標準序列。