卵黃蛋白原的產生及其非營養功能的研究現狀

霍巖 陳曉英 方榮祥 張莉莉

（1. 植物基因組學國家重點實驗室，北京 100101；2. 中國科學院微生物研究所，北京 100101）

卵黃蛋白原（Vitellogenin，Vg），分子量約200 kD，在卵生動物體中是一種重要的營養蛋白。在卵形成過程中，Vg攜帶修飾在蛋白上的營養物質一并經運輸入卵，在卵內被加工成為成熟的卵黃蛋白（Vitellin，Vn）。Vn在卵內積累，為后期胚胎的發育提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、磷、硫及微量元素等［1-4］。作為一種生殖營養蛋白，Vg一般在卵黃發育期受到激素的誘導［5-7］，在昆蟲雌性成蟲的脂肪體、魚類的肝臟或者其他的動物的特定組織中特異性地大量表達，并通過定位于卵巢的Vg受體（Vg receptor，VgR）所介導的內吞作用入卵［8-11］。Vg準確的時空特異性表達決定了卵的正常發育［12］。Vg在卵巢外組織中翻譯為前體蛋白之后，會經歷一系列加工過程，包括蛋白修飾、剪切、分泌、運輸、受體識別等。不同的Vg剪切形式及其時空表達，能介導不同的生物學功能。例如，在Vg運輸過程中，在血淋巴內，特定剪切形式的Vg被證明與病毒表面蛋白互作［13］，將病毒攜帶入卵實現其垂直傳播的過程；對于病原微生物，Vg通過與病原蛋白的分子互作直接殺菌，或間接介導昆蟲對微生物的免疫識別［14-16］。本文將綜述Vg的基本結構、加工運輸及近年來在Vg非營養功能方面的新進展，旨為后續Vg的功能研究提供指導。和灰飛虱體內均發現大量的Vg小亞基單獨由脂肪體分泌并向卵巢運輸的現象，Vg在該區域的高度修飾有可能在其介導的營養輸送中發揮主要功能。DUF和vWD兩個結構域均具有與病毒或細菌互作的性質，對微生物進行識別并介導微生物的清除或垂直傳播［13，21］。在三維結構上，位于N末端的VitN的主要結構是N-折疊；其后是一段α螺旋結構，其和位于C端結構域的序列，形成一個“脂穴”結構，是脂肪分子結合的主要部位［12］。

1 Vg的基本結構

不同來源的Vg在結構上具有高度的保守性：其N端為引導蛋白分泌的信號肽序列，從N端到C端依次編碼3個結構域：卵黃蛋白原N端結構域（Vitellogenin N domain，VitN），未知功能結構域（Unknown function domain，DUF）和血管性血友病因子結構域（von Willebrand domain，vWD）［8］。VitN結構域的主要特點包括：（1）多數Vg同源蛋白在該結構域內編碼兩個由連續絲氨酸組成的絲氨酸聚集區，是Vg的主要磷酸化位點，兩個絲氨酸聚集區之間具有保守的Arg-X-Arg/Lys-Arg（RXR/KR）酶切位點，幾乎所有Vg均能在該位點被特異的蛋白酶剪切形成N端小亞基和C端大亞基，剪切后的Vg亞基以聚合體形式一起分泌至血淋巴中；（2）該結構域內具有分泌信號肽和Vg與VgR的互作位點，因此單獨的Vg小亞基能夠完成向卵母細胞內的運輸功能，絲氨酸的磷酸化對Vg的剪切及Vg-VgR的識別具有重要作用［17-18］；（3）該結構域是重要的蛋白修飾區域，高達16%（W/W）位置被酯化，能結合25-40個脂肪；2/3的區域被磷酸化［19-20］。在蜜蜂

2 Vg的表達、加工及運輸

2.1 Vg的表達

Vg傳統上被認為是在雌性個體處于卵巢發育期時特異性地誘導表達［6］，卵生脊椎動物的肝臟和昆蟲的脂肪體是Vg的主要合成加工部位。以昆蟲為例，在幼蟲期Vg不表達或表達水平很低，或Vg在非脂肪體細胞中進行表達；變成成蟲后進入了生殖生長階段，脂肪體中的Vg開始跳躍式地高表達，并且在產卵過程中一直維持很高的水平。對于沒有交配的雌蟲，Vg的表達則明顯降低［22-23］。除了脂肪體，在卵巢發育過程中，卵巢上的濾泡細胞也會合成部分Vg，為卵發育提供營養物質［24］。

近年來對多個物種的Vg研究發現，除在卵巢發育期為了供給營養使得Vg大量表達之外，在幼蟲、雄蟲、或者各齡期昆蟲的其它組織中也發現有一定量的Vg表達。在功能性不育的蜜蜂的工蜂體內，其下咽腺及與之毗鄰的頭部脂肪體細胞均能合成Vg，暗示了Vg用于育雛食物的功能；Bombus hypocrita的蜂后、工蜂及雄蜂從蛹到成蟲的各個發育階段Vg都能以不同的水平表達［25］；Camponotus festinatus的Vg在蜂后及工蜂體內以不同豐度進行表達，在成蟲羽化前Vg的合成水平較低［26］。Leucophaea maderae的雌性和雄性脂肪體細胞均有Vg表達［27］；我們近期對灰飛虱的研究發現在灰飛虱體內，雄蟲和幼蟲都能穩定表達Vg，與雌蟲不同，非雌性昆蟲的Vg僅表達于其血細胞內，而在Vg主要合成組織脂肪體內則完全沒有表達［28］。

2.2 Vg的表達調節

Vg通常在特定的發育時期大量表達，其產生、加工甚至運輸均依賴激素的調節作用［2-3，10］。調節Vg產生的激素主要為保幼激素（Juvenile hormone，JH），某些物種中蛻皮素和神經肽也能協助JH調節Vg［29-30］。在調節卵巢發育及Vg產生相關的基因的上游通常結合有重要的應答原件，包括激素受體。在卵巢發育期，JH增多并作為配體分子與激素受體結合，進而誘導相應基因的表達。飛蝗脂肪體中的伴侶蛋白Grp78（78 kD glucose-regulated protein）能協助Vg在內質網上翻譯產生時正確折疊，JH能夠誘導Grp78基因的表達，從而對Vg的表達產生調控［31］。JH同時能調節蝗蟲的Cdc6（cell-divisioncycle 6）基因，促使脂肪體和卵泡細胞的多倍體化，誘導Vg的表達和卵巢的正常發育［32］。對于大多數昆蟲，JH能通過調節多種基因的表達并最終促進Vg的產生，而蜜蜂中，JH對Vg的產生是負調控作用——JH抑制Vg的表達［33］。利用激素對Vg的調節作用，人為干擾生物體內的激素水平，甚至可以導致生物的“變性”，在雄性個體中誘發Vg的表達。當在雄性蟑螂體內注射入JH時，也能誘發Vg的產生，盡管產生的Vg后期加工與雌蟲不同［34］。這類情況不止發生在昆蟲中，在魚類也會發生：受水體到外界污染時，雄魚體內JH會上調，能誘發Vg的表達［35-36］。

昆蟲的卵黃發育需要營養物質供給，營養狀態決定了卵黃發育水平，尤其在蚊子這類吸血昆蟲中，只有在攝取了血液后，才能開啟Vg表達和卵巢發育［37］。研究表明無論JH對Vg是正調控還是負調控，營養物通過調控激素水平間接地正向調控Vg的表達。褐飛虱中，氨基酸營養能通過促進JH的合成來促進Vg的合成［38］。而在蜜蜂中，缺乏營養時，IIS（Insulin-IGF-1 signaling）表達上調，IIS和受體結合，激發下游的激酶活性，磷酸化FOXO，從而解除其對JH的抑制功能，導致JH上調，從而抑制Vg的表達［39］。

2.3 Vg的剪切

Vg的剪切通過枯草芽孢桿菌酶及其同工酶完成，該類酶具有furin結構域，識別RXXR位點并在第四位R之后發生剪切［40］。大多數Vg同源蛋白具有一個或以上的RXXR位點，其中最保守的RXR/KR位于N端兩個絲氨酸聚集區之間，在該位點的酶切產生N端小亞基和C端大亞基［8］。對具有多個RXXR位點的Vg同源蛋白，其酶切發生于部分RXXR位點，需要通過實驗對酶切位點進行驗證。例如，褐飛虱Vg有3個RXXR位點，僅在最保守的位點進行剪切［41］；蟑螂Vg有5個酶切位點，剪切發生在其中3個位點之后［42］。除位點特異性剪切外，Vg也會被組織特異性或發育階段特異性剪切。例如淡水蝦的Vg在脂肪體中被枯草芽孢桿菌酶切產生大小兩個亞基，并分泌至血淋巴中，在血淋巴中，Vg大亞基進一步被剪切為兩個中等大小的亞基［43］；蟑螂雌性和雄性血淋巴中含有種類不同的Vg亞基［29］。經剪切的Vg亞基在進入卵巢之后會進一步加工并最終形成成熟的卵黃蛋白。本實驗室最近的研究發現灰飛虱Vg有5個RXXR位點，酶切可以發生在其中兩個位點之后，N端保守RXRR位點的酶切發生在入卵之前，C端大亞基的二次酶切則發生在入卵之后［28］；在雄性灰飛虱體內，Vg僅由血細胞表達且不發生剪切，以全長形式分布于血細胞和血淋巴中，在水稻條紋病毒RSV的水平傳播中發揮功能［28］。由于Vg是多亞基組成的蛋白，剪切產生的含有不同亞基組成的Vg片段是否發揮不同的生物學功能是未來Vg研究的重要內容之一。我們對灰飛虱Vg的不同分子形式進行功能鑒定，發現其脂肪體加工產生的Vg N端小亞基可以分泌并入卵，但是由于缺乏與病毒RSV互作的vWD及DUF結構域，不能介導病毒的傳播；而其血細胞產生的Vg含有C端RSV互作結構域，因而在體內發揮傳播RSV的功能［28］。

2.4 Vg的運輸

卵巢到達卵黃發育期，VgR在激素誘導下表達，開始介導Vg向卵內的運輸［44-45］。Vg通過卵泡細胞的間隙到達卵母細胞表面，其VitN結構域與VgR結合，通過內吞作用將Vg運輸到卵內［17］。Vg被VgR介導內吞進入卵細胞，快速被運輸到初級內涵體，在內涵體中，v-ATPase介導的酸性環境，使Vg和VgR分離［10］。內涵體的酸性環境活化其內的組織蛋白酶活性，對Vg進行切割，加工成為成熟的Vn，Vn在卵內聚集在光鏡可見的卵黃體中，后期，為胚胎發育提供營養。此外，除了直接被卵細胞上的VgR識別，有些物種內，卵巢的其他種類細胞也可以吸收Vg，如在灰飛虱中，Vg除直接被卵細胞吸收之外，還可以進入滋養區的營養細胞內，通過營養細胞與卵細胞相連的營養絲間接運輸至卵母細胞內［13］。

3 Vg的非營養功能

3.1 Vg介導微生物的垂直傳播

卵生動物及昆蟲體內均攜帶多種共生或病原微生物，包括細菌與真菌性共生菌，病毒病原菌等。作為卵生動物最重要的營養運輸蛋白，Vg被微生物劫持實現自身入卵傳播的研究得到了越來越多的例證（表1）。如在褐飛虱的血淋巴及卵巢中，酵母類共生菌周圍有大量的Vg聚集，暗示其入卵運輸與Vg的密切關系［46］；果蠅體內的ZAM病毒是一種卵傳病毒，在感染ZAM病毒的卵巢中，ZAM出現在含Vg的內吞小泡中，干擾果蠅VgR同時影響了Vg及ZAM病毒的入卵過程［47-48］；果蠅細胞內共生細菌Spiroplasma poulsonii在血淋巴中與Vg互作并因此被運輸至卵黃體中［49］；干擾蜱蟲的VgR會影響其卵巢發育，進而影響Vg及巴貝西蟲的入卵能力［50］。

表1 Vg的非營養功能

在植物病毒經介體昆蟲傳播的過程中，病毒經卵傳播至子代，在幼蟲體內過冬并在來年侵染植物，增加了植物病毒病害的防治難度，也使得對病毒在介體昆蟲體內的垂直傳播機理成為重要的研究內容。近年來在植物病毒經介體昆蟲卵傳的研究取得了一系列重要的成果。其中之一為RSV在灰飛虱體內的垂直傳播過程。研究發現RSV的入卵傳播路徑與灰飛虱Vg進入滋養區營養細胞并進而進入卵母細胞的過程高度一致，機理研究表明RSV的結構蛋白能與灰飛虱Vg的DUF和vWD結構域發生體外分子互作，在體內，RSV與Vg的C端大亞基在血細胞中結合并分泌至血淋巴［28］，運輸至卵巢滋養區，RSVVg復合體通過Vg與營養細胞表面VgR的分子互作，突破卵巢屏障，并最終進入到卵母細胞內，垂直傳播至子代灰飛虱［13］。水稻黑條矮縮病毒也能經灰飛虱進行水平傳播，但不能垂直傳播至子代，我們的工作發現該病毒的結構蛋白不能與灰飛虱Vg發生分子互作。

這種植物病毒借助Vg運輸途徑進行垂直傳播的機制在植物病毒的傳播中有一定的共性。最新近的研究證明了煙粉虱Vg在雙生病毒垂直傳播過程中的功能，為昆蟲Vg介導的病毒卵傳提供了新的例證［51］。番茄黃化卷葉病毒TYLCV能以持久循環方式經由其介體煙粉虱進行傳播，TYLCV進入煙粉虱生殖器官的能力與煙粉虱卵巢的發育階段密切相關，隨著煙粉虱成蟲蟲齡的增加，TYLCV垂直傳播至子代昆蟲的幾率大大增加。機理研究表明了該病毒外殼蛋白與昆蟲Vg的分子互作，干擾Vg表達水平能抑制病毒的入卵幾率。與灰飛虱傳水稻黑條矮縮病毒相似，煙粉虱的Vg與中國番木瓜曲葉病毒的外殼蛋白不發生互作，該病毒也因此不能被煙粉虱垂直傳播至子代。

3.2 Vg的免疫功能及介導隔代免疫

血液或淋巴液是動物的循環系統，也是免疫作用的主要場所之一，Vg在通過血液或血淋巴進行運輸的過程中發揮免疫功能，直接或間接清除病原微生物的性質首先在魚類研究中得到了較多的例證。魚的Vg可以作為模式識別分子，識別細菌細胞壁脂多糖和脂磷壁酸，直接促使細菌裂解［52］；在體外實驗中，將魚的Vg添加至細菌生長液中，抑制細菌的生長［53］；魚的Vg也可以作為調理素分子激活Fcγ受體介導的吞噬作用對病原菌進行間接的清除［54］；在與病毒互作的研究中，Vg被發現能結合至病毒表面，通過對病毒粒子進行交聯而將其中和［55］。昆蟲Vg的免疫相關功能首先在蚊子中得到解析，蚊子的含硫酯鍵蛋白（Thioester-containing protein 1，TEP1）介導瘧原蟲的免疫清除，Vg通過降低TEP1的表達間接調控了蚊子對瘧原蟲的清除效力［16］；蜜蜂的Vg受傷口誘導，并與壞死細胞的細胞膜結合激發溶酶體的消化功能，加速細胞的清除過程［56-57］；蜜蜂血細胞的生長需要重要的微量元素鋅，Vg作為營養物質能和健康的血細胞互作，為其提供鋅離子，以維持血細胞的生長及功能［58］。

Vg經血淋巴傳播至子代的過程中，與其結合的微生物分子被攜帶入卵，則會介導免疫信號的隔代傳遞［15］?？绱庖咚兀═rans-generational immune priming，TGIP）將母體內的免疫記憶傳給后代，以對后代起到初始保護作用。在脊椎動物中，母體以抗體作為TGIP傳遞免疫記憶，而昆蟲則將其體內誘發先天免疫的病原微生物抗原作為TGIP，通過卵將免疫記憶傳給后代。以蜜蜂為例，其Vg與芽孢桿菌的細胞壁脂磷壁酸及大腸桿菌的細胞壁脂多糖互作，攜帶這些微生物碎片入卵，促進子代昆蟲的免疫系統初建［15］。

圖1 卵黃蛋白原的產生、運輸及功能

3.3 Vg的行為調節功能

在對社會型昆蟲的研究中發現，Vg對昆蟲的覓食行為有重要的調節作用［59］。對甲殼蟲研究發現，其大腦能表達VgR，Vg因此能運輸到大腦中，通過調節神經系統來實現對昆蟲行為的調節［60］，這種機制對于了解Vg在多種完全社會型及半社會型昆蟲中的行為調節能力具有指導意義。Vg對自由基的結合，能保護健康細胞免于傷害，從而對蜜蜂的壽命起到重要的調節作用，Vg表達水平的不同，導致夏季生工蜂的壽命僅有6周，而冬季生工蜂能存活數月［61］。在蜜蜂的社會分工中，蜂王的功能是繁育后代，社會地位高，獲得比工蜂和雄蜂更多的營養供給。充分的營養物質能降低IIS（Insulin-IGF-1 signaling），抑制保佑激素的產生，解除JH對Vg的抑制功能，提高Vg表達水平及蜂王的產卵能力［39］。

4 總結及討論

Vg作為卵黃蛋白的前體，其產生、加工及運輸過程在不同的動物間比較保守：在動物肝臟或昆蟲脂肪體細胞中，Vg的mRNA翻譯合成Vg蛋白前體，通過糖基化、磷酸化、酯化等修飾及枯草芽孢桿菌酶剪切，形成亞基，分泌至血淋巴并運輸至卵巢，其N端的VgR識別位點與VgR結合，通過內吞作用運輸到卵細胞中，為胚胎發育提供營養。Vg在從血淋巴向卵巢運輸過程中，會與微生物發生多種形式的互作，通過直接或間接的免疫功能清除病原微生物，或通過與微生物的互作攜帶微生物進行垂直傳播，或通過與微生物碎片的互作，將免疫信號傳遞給子代（圖1）。對Vg非營養功能的研究集中于Vg與微生物互作及由此引發的促進微生物傳播或通過免疫清除微生物的過程，深入了解Vg的非營養功能，需要了解Vg在卵巢外的多種剪切策略；由此產生的不同Vg分子形式，將介導多樣化的生物學功能。

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