大豆疫霉與大豆互作中的識別與反識別

譚新偉 靳雨婷 劉美彤 王群青，2

（1. 山東農業大學植物保護學院 山東省農業微生物重點實驗室，泰安 271018；2. 教育部農作物生物災害綜合治理重點實驗室 農業部華東作物有害生物綜合治理重點實驗室，南京 210095）

大豆（Glycine max L.）是重要的油料和糧食作物，市場需求巨大。目前大豆產量的制約因素主要是氣候變化和病害［1］。大豆疫霉（Phytophthora sojae）引發的大豆疫病，又稱大豆疫霉根莖腐病，是大豆生產中的一種毀滅性病害，每年在全球范圍內造成10-20億美元的經濟損失［2］。生產中控制大豆疫病的主要方法是利用植物抗性進行抗病品種選育。為實現這一目標，在分子層面對大豆疫霉與大豆的相互作用進行深入的研究具有重要的理論價值和實踐意義［3］。目前對于大豆疫霉與大豆互作的研究主要集中在病原菌效應分子毒性作用、寄主抗性及兩者之間的分子互作機制方面［4］，本文重點剖析目前大豆抗性產生和喪失的原因，探討了效應分子的反識別分子策略，以及利用疫霉菌保守分子靶標設計開發新型抗病資源的可能性。

1 大豆疫霉與大豆疫病

由疫霉菌引起的大豆疫病于20世紀50年代在北美被發現，并因此確立了一個病原菌新種即大豆疫霉［5］。大豆疫霉是一類卵菌病原微生物，自然條件下僅能侵染大豆和羽扇豆［2，6］。大豆疫霉可為害大豆的整個生長期，包括出土前的爛種、幼苗爛苗及猝死、成株期根莖腐以及侵染葉片造成的黃化枯萎等［3］。大豆疫霉是一種兼性病原菌，在親和互作條件下侵染4 h后，侵入的菌絲不斷在寄主細胞間擴展，并形成多個吸器，獲取寄主的營養和水分［2］。侵染15 h后，感病寄主開始出現壞疽癥狀，說明大豆疫霉已經由寄生階段向死體營養階段轉變［2］。

由于大豆疫霉侵染速度快，病程發展迅速，往往來不及施藥進行化學防治，因此大豆疫病是大豆生產上造成損失最嚴重，也是最難防治的病害之一［7］。大豆疫霉屬于卵菌而不是真菌，對很多殺菌劑不敏感，極難通過化學農藥對其進行有效防治［2］。而且大豆疫霉及其代表的卵菌病原菌具有非常豐富的遺傳多樣性，在田間變異極其迅速，往往在很短的時間內即可使化學農藥喪失效果［8-9］。目前生產上防治大豆疫病主要依賴抗病育種［4］。大豆與大豆疫霉的互作符合基因對基因假說，因此培育和種植抗病品種是最經濟、安全、有效的防控策略。

大豆對大豆疫霉的小種專化性抗性是由抗病（Resistance to P.sojae，Rps）基因介導的免疫反應限制大豆疫霉的侵染來實現的，迄今已鑒定并定名了13個Rps基因［2］。然而，田間大豆疫霉變異迅速，加之大多數品種抗源單一，在推廣8-15年后就會喪失原有的抗性［2］。以美國俄亥俄州為例，在1972年推廣抗病品種之前田間只發現1號生理小種，而隨后7年內就鑒定出7個新生理小種，到1998年則增加至55個，同時有78.9%的田塊鑒定出有克服抗病基因的疫霉菌株［10］。目前所有已知抗病基因均被大豆疫霉菌“擊敗”，因此迫切需要拓寬新的抗病資源。

同時在田間還存在耐病性的品種，即大豆品種可以忍受一定程度的發病而造成有限的產量損失。耐病性由多基因控制，也稱部分抗性或數量抗性，對所有大豆疫霉的致病型均能夠產生作用，抑制病斑的擴展，在田間一般產量損失較少［10］。隨著田間抗病品種的推廣，病原菌的毒力型在選擇壓力下快速變異，造成質量抗性的使用壽命縮短，因此具有廣譜抗性的耐病品種選育也越來越受到關注。

2 大豆與大豆疫霉相互識別的分子基礎

識別（Recognition）是植物-病原菌直接互作的最初階段［11］。大豆與大豆疫霉的相互識別，一方面是病原菌通過識別寄主的化學、電位及物理特征，開啟并控制侵染的過程；另一方面則是寄主通過識別病原菌相關分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和效應分子（Effectors），觸發一系列的免疫防衛反應［11-14］。

2.1 大豆疫霉特異性識別大豆

研究顯示，大豆疫霉游動孢子能被大豆或鷹嘴豆的根部分泌物如大豆異黃酮所吸引，這些分泌物即使被稀釋到500倍，仍然對游動孢子具有極強的吸引力［15-16］。Zhang等［17-18］的研究表明，大豆疫霉G蛋白α亞基PsGPA1及下游的互作蛋白PsHint1共同參與調控游動孢子對異黃酮物質的趨化性，并且還控制附著胞形成、活性氧清除、效應分子的轉錄及激發子類似基因的表達等一系列侵染過程。對大豆疫霉的一個G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor，GPCR）蛋白PsGPR11的研究發現，其對游動孢子的游動時間、休止孢萌發及游動孢子致病性等都有顯著影響［19］。而對另外一個偶聯磷脂酰肌醇磷酸激酶PIPK的大豆疫霉GPCR蛋白PsGK4的研究也發現，其控制著游動孢子的休止及休止孢萌發［20］。這說明大豆疫霉的游動孢子在不斷的通過感知外界特別是寄主化學物質的變化而調控自身的發育過程，包括休止和萌發。

游動孢子形成休止孢和隨后休止孢的萌發受到一系列環境因素的影響，如水流的擾動、大豆異黃酮刺激、根部物理表面以及鈣離子的或其它營養元素的接觸［21］。休止孢萌發后產生伸長的芽管，尋找到表皮細胞垂周壁之間的縫隙后開始侵入［22］。至于芽管是如何精確地找到侵入位點還沒有明確的研究結果，有一種可能性就是在垂周壁之間的結合處存在相對高濃度的某種化學物質而使芽管具有向觸性［23］。一旦尋找到這樣一個侵入點，芽管就開始穿透寄主細胞壁，并在寄主細胞間形成侵染菌絲，通過菌絲的變態結構吸器獲取水分和營養，進入病程快速發展的階段［2，23］。至此，大豆疫霉將按照固定的程序轉錄調控各種效應分子，協同控制對寄主的侵染過程［13］。

2.2 大豆特異性識別大豆疫霉

大豆與大豆疫霉的互作符合基因對基因假說，因此在育種上經常利用這種小種水平的專化抗性來培育抗病品種。無論在親和互作還是在非親和互作條件下，大豆疫霉均可完成從游動孢子到形成吸器的侵入過程，但在抗病品種上不能進一步擴展［24］。植物防衛反應開啟的前提條件就是在侵染過程中識別到入侵的病原微生物，識別病原微生物也是植物先天免疫反應中最基本和最重要的組成部分［11］。現代分子植物病理學家提出了植物免疫系統理論，認為抗病植株通過識別PAMP或者效應分子，開啟兩種不同層面的抗病反應，即病原相關分子模式PAMP觸發的免疫反應（PAMP-triggered immunity，PTI）和效應子effector觸發的免疫反應（Effectortriggered immunity，ETI）［12］。

2.2.1 大豆識別大豆疫霉的PAMP觸發PTI 病原相關分子模式PAMP是一類保守的病原分子，通常不能夠通過進化而退化或去除［12］。PAMP觸發的免疫反應主要體現在植物的基礎抗性和非寄主抗性上。植物利用類似受體的蛋白激酶（Receptorlike proteins or -kinases，RLP/Ks）來感知病原微生物保守的PAMP分子［12］。疫霉菌的PAMP包括了很多蛋白、多糖及小分子物質，往往可以激發寄主和非寄主植物的防衛反應，因此也被稱作激發子（Elicitor）［25］。例如，在疫霉菌中存在著一類保守的小分子甾醇結合蛋白，這些蛋白只有98個氨基酸大小，但卻是疫霉菌從植物中獲取甾醇所必須的。這些疫霉菌特有的小蛋白能夠激發模式植物煙草的防衛反應，并誘導產生對細菌、真菌和病毒的抗性，因此被稱作 Elicitins［26］。

另外，大豆疫霉的細胞壁成分β-1，3-葡聚糖也可以成功觸發大豆的防衛反應［25，27］。當休止孢萌發或遭遇到大豆外泌葡聚糖酶的時候，大豆疫霉細胞壁降解產生的碎片也會激發植物PTI［28］。研究發現大豆疫霉細胞壁上的一個糖蛋白C端13個氨基酸（VWNQPVRGFKVYE，PEP-13）的短肽段即可成功觸發植物PTI［29］。疫霉菌細胞壁上的另一個糖蛋白（Cellulose-binding elicitor lectin，CBEL）也可以觸發煙草的PTI，并誘導植物產生系統獲得抗性［30］。

除了這些來源于病原微生物本身的PAMPs，當病原微生物侵染植物時，破壞或降解植物組織而產生的一些代謝成分也能夠被植物識別，觸發植物的免疫反應［31］。對于可以主動侵入寄主的真菌及卵菌來說，在侵染過程中會釋放大量的細胞壁降解酶，來破壞寄主的細胞壁。一方面，這些酶類降解植物細胞壁產生的碎片或產物能觸發寄主免疫反應；另一方面，這些酶蛋白本身也可作為病原相關的分子模式直接被植物識別［31-33］。例如，大豆疫霉的外泌木葡聚糖酶PsXEG1，可以強烈的觸發植物細胞死亡［34］。研究表明，大豆對PsXEG1毒性的抑制依賴于GmGIP1（Glucanase inhibitor protein 1）蛋白與其直接互作［14］。有趣的是，大豆疫霉為了逃避寄主對PsXEG1的識別，還分泌出一個與GmGIP1結合能力更強的蛋白PsXLP1（XEG1-like protein 1）來作為誘餌（Decoy），保護 PsXEG1 的毒性作用［14，35］。雖然PsXLP1與PsXEG1在序列上高度同源，但從植物免疫系統的角度出發，可以將PsXEG1定義為大豆疫霉的PAMP，而將PsXLP1劃分到胞外效應分子范疇。2.2.2 大豆識別大豆疫霉的效應分子觸發ETI 大豆疫霉基因組中有大量具有豐富多樣性的毒性相關基因家族［6，36］。這些基因家族編碼了蛋白水解酶、水解酶抑制蛋白、毒素蛋白等胞外效應分子以及兩類龐大的胞內RXLR和Crinklers（CRN）效應分子家族［6，36-37］。

無論是在植物胞內還是胞外起作用的效應分子，都是具有功能模塊的分泌蛋白，蛋白N端具有信號肽，而C端則是毒性功能域［37］。而胞內效應分子一般還具有一個寄主錨定序列，負責將效應分子轉運到植物細胞內。例如，RXLR效應分子家族就是以其寄主錨定序列精氨酸R-X-亮氨酸L-精氨酸R（X代表任意氨基酸）來命名的，這類效應分子家族的成員則多達 350 個［2，37］。

目前克隆的大豆疫霉無毒基因均屬于RXLR效應分子家族［36，38-47］，說明大豆抗病蛋白是在胞內對這些無毒蛋白產生識別的。然而有趣的是，盡管研究者通過酵母雙雜交、Co-IP等技術在持續尋找這些無毒蛋白的互作蛋白，卻沒能篩選到與之直接互作的抗病R蛋白。甚至已經被克隆的抗病蛋白Rps1k也已經驗證不能直接和無毒蛋白Avr1k互作［39］。這說明大豆對大豆疫霉RXLR效應分子的識別機制非常復雜，并非簡單的通過直接互作來實現。

研究還發現，一些RXLR效應分子如Avh18、Avh25、Avh105、Avh147、Avh238和 Avh241等 都能被植物識別并引起大豆細胞的過敏性死亡［13］。

Crinklers因其能引起煙草細胞皺縮壞死（Crinkle）而被命名，其蛋白也具有保守的寄主錨定序列LXLFLAK，預測其具有將CRN效應分子轉運至植物細胞的功能。大豆疫霉中有200多個CRN效應分子，一些Crinkler能夠被植物識別導致細胞死亡，如 PsCRN63［48］。

3 大豆疫霉逃避寄主識別的分子策略

3.1 大豆疫霉抑制寄主的PTI反應

由于PAMP分子的保守特性，疫霉菌和其它病原菌都采用泌出效應分子來干擾或者破壞植物的PTI反應，達到成功侵染的目的［12］。研究表明，在大豆疫霉侵染前期上調表達的一系列效應分子具有抑制寄主PTI的功能［13，34］。例如，大豆疫霉RXLR效應分子Avh238，在侵染前12 h內上調了約120倍。研究發現Avh238能夠抑制疫霉菌Elicitin（INF1）在煙草細胞中觸發的超敏反應（Hypersensitive response，HR），同時對PTI信號通路上的關鍵激酶NPK1和MKK1觸發的HR反應具有抑制作用［13］。而大豆疫霉PsXEG1作為一類保守的PAMP分子，其引發的植物免疫反應也能夠被多個RXLR效應分子所抑制，如Avh52、Avh62、Avh94和Avh109等都能夠抑制PsXEG1觸發的活性氧迸發、HR反應以及PTI相關基因的表達［34］。

3.2 大豆疫霉無毒基因的反識別機制

目前克隆的大豆疫霉無毒基因都屬于RXLR效應分子家族，包括Avr1a、Avr1b、Avr1c、Avr1d、Avr1k、Avr3a/5、Avr3b、Avr3c 和 Avr4/6［36，38-47］。 目前識別這些無毒基因并觸發免疫反應的抗病基因在田間已經陸續被“攻克”。因此，了解無毒基因逃避寄主識別的分子機制，是了解品種抗性喪失、針對性開發新抗病資源的急切需求。

Avr1b是第一個被克隆的疫霉菌無毒基因，在無毒菌株P7064中有著高量的mRNA積累，而在毒性菌株P7373和P7074中則因為啟動子區插入了一個3 kb的片段而喪失了mRNA的積累，在毒性菌株P6497中則完全沉默［49］。類似基因沉默的策略在無毒基因Avr1a、Avr1c、Avr3a/5和Avr4/6中也存在［40，46-47，50］。Avr1b 在毒性菌株中還存在著多種序列多態性，如毒性菌株P7076的C末端存在著21個氨基酸的變異，如此劇烈的序列突變也使Avr1bP7076成功逃避了抗病蛋白的識別［51］。類似采用序列變異來逃避識別的還有無毒基因Avr3a/5、Avr3b和Avr3c［42-43，45］。對于無毒基因 Avr1d 來說，盡管其蛋白C末端也存在著劇烈的變異，但是沒有對抗病蛋白Rps1d的識別造成影響［41］。通過對無毒菌株和有毒菌株的基因組進行比較發現，在毒性菌株中缺失了Avr1d的序列，而采取類似的基因剔除策略的無毒基因還有 Avr1a 和 Avr1c［40-41，47］。有的無毒基因如Avr3b和Avr1k則因為序列的插入和變異造成移碼突變而使蛋白的翻譯提前終止，卻恰好逃避了無毒蛋白對其的識別［39，43-44］。

大豆疫霉無毒基因的這種遺傳多樣性，也反映出大豆抗病品種對其施加的選擇壓力。由于大豆疫霉進化速度快，某些突變造成的無毒性喪失會迅速形成新的優勢小種，使得品種中由Rps基因控制的質量抗性失效變得感病，造成嚴重的損失。

3.3 大豆疫霉效應分子協同互作抑制ETI

對大豆疫霉4個菌株的基因組及轉錄組研究發現，RXLR效應分子的轉錄模式可以分為誘導表達和持續轉錄兩種模型，并面臨著不同的進化選擇壓力［13］。對于誘導表達的效應分子來說，因為表達量較高通常會面臨巨大的選擇壓力。如大豆疫霉的RXLR效應分子Avh238，在侵染前期劇烈上調表達，大豆、煙草和一些茄科作物都能夠識別Avh238并產生ETI［52］。然而在大豆疫霉中還存在多個效應分子能夠抑制Avh238被植物識別所產生的ETI反應［13］。這些抑制ETI的效應分子不僅包括了一些低表達量的RXLR效應分子，還包括了一些CRN效應分子［48］。

對于無毒基因和抗病基因互作所觸發的過敏性壞死反應，也能夠被一些效應分子所抑制，如Avh172、Avh6都能夠抑制致病疫霉無毒蛋白Avr3a和馬鈴薯抗病蛋白R3a之間的互作［13］。而Avr1d也能夠抑制Avr1b和Rps1b之間的互作［41］。說明在大豆疫霉和大豆的協同進化過程中，大豆疫霉不斷產生新的效應分子來抑制寄主的防衛反應，而對于大豆來說，由于自身進化和育種周期的限制，往往無法及時應對大豆疫霉進化產生的優勢生理小種。

4 總結與展望

大豆疫霉造成的大豆疫病已經嚴重威脅到大豆產業的發展。在我國主要大豆產區，大豆疫病也呈現逐漸加重的趨勢。在農業面源污染嚴重、倡導綠色農業的大環境下，推廣使用抗病品種控制大豆疫病是減施農藥、實現農藥零增長的迫切要求。然而大豆疫霉在田間變異迅速，已經陸續攻克了所有目前已知的抗病基因。因此針對性的挖掘新型的抗病基因，拓寬抗病育種資源，通過傳統育種技術與分子育種技術結合實現精準育種將是未來大豆抗病育種的發展方向。

從目前大豆疫霉和大豆的互作研究發現，寄主主要是通過識別保守的PAMP或者RXLR效應分子開啟免疫防衛反應。因此，這兩類大豆疫霉特有的病原分子是開發大豆新型抗病育種靶標的主要研究對象。

PAMP是非常保守、不易通過進化而除去的一類病原分子。目前研究者也在著力挖掘新的大豆疫霉PAMP，針對性地設計病害防控策略［11，34］。如大豆疫霉的木葡聚糖酶PsXEG1就是一類新發現的PAMP［34］。研究發現這一類木葡聚糖酶家族蛋白在多種大豆根部病原菌如鐮刀菌中都有保守序列存在，如果能找到植物中識別XEG1并誘導植物抗病性的免疫組件，并通過基因編輯使之更加特異地與大豆疫霉和鐮刀菌的XEG1蛋白結合，則會極大地增強大豆抗根部病害能力，有助于構建持久抗病性作物。

而對于進化較快的胞內效應分子，研究者也在基于其進化和毒性的機制而開發新的抗病靶標［53］。對于數量眾多的RXLR效應分子來說，既然能夠主動通過基因沉默或刪除突變來逃避寄主的識別，說明其功能在一定程度上是冗余的［54］。而對于一些具有時空表達特性和重要功能的效應分子如Avh238、Avh172來說，又是病原菌在侵染過程中不可或缺的一部分［13］。因此，為了避免效應分子的快速進化而造成的抗性丟失，在選擇RXLR效應分子作為靶標篩選抗源的時候要遵循3個基本原則：病原菌毒力所必需、在不同菌株中保守存在以及面臨較低的選擇壓力。結合目前的基因組和轉錄組數據，可以將篩選的范圍縮小至幾十個甚至十幾個RXLR效應分子的規模。然后再對這些效應分子進行基因沉默或者敲除等遺傳操作，對轉化子的毒力進行評估，即可篩選到合適的抗源靶標。根據俄勒岡州立大學基因組研究及生物計算中心的報道，有3個效應分子Avh16、Avh180和Avh240基本符合這個篩選規則。而在栽培大豆和野生大豆的多個株系中也獲得了相應的抗源（未發表數據）。這些新穎的抗源材料，將有助于新一代抗病品種的育種開發和推廣。

隨著分子生物學技術的發展，農作物育種也正在從傳統育種走向精確育種。針對病原菌的侵染特點，精準設計抗病策略，精確設計育種靶標，通過分子育種實現各類優良基因的聚合，培育“理想品種”，將是未來農作物育種的發展方向。

長期以來對大豆抗性的研究一直集中在抗病基因的鑒定上，育種和生產上也一直通過Rps基因介導的質量抗性對大豆疫病進行防治［55］。然而大豆疫霉種群在抗性品種的選擇壓力下會迅速變異，毒力結構呈現越來越復雜的趨勢，導致單基因控制的質量抗性喪失效果。為構筑大豆對疫霉菌的持久抗病性，在深入了解大豆疫霉逃避寄主免疫機制的前提下，統籌聚合新挖掘的單基因抗性和優質數量抗性資源，最終通過精準育種才能獲得廣譜抗病的理想大豆品種。

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