水稻/擬南芥防御病原細菌入侵的表觀遺傳調控研究進展

徐以華 黎起秦 劉連盟 王玲 丁新華 侯雨萱 黃世文

（1. 中國水稻研究所水稻生物學國家重點實驗室，杭州 310006；2. 廣西大學農學院，南寧 530003；3. 山東農業大學植物保護學院，泰安 271018）

在生長發育過程中，植物不可避免的會受到真菌、細菌、病毒以及昆蟲等各種生物的攻擊。雖然植物不具備免疫細胞，但是面對病原菌的入侵，植物相應的進化出了復雜的應對機制——免疫防御反應。植物主要依靠與病原菌相關的分子模式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP）或病原菌攻擊時產生的內源分子，即損傷相關模式（Damageassociated molecular patterns，DAMPs）誘發的廣譜性防御（PAMP Triggered Immunity，PTI）和 病原菌來源的效應子激發的特異性免疫反應（Effector Triggered Immunity，ETI）抵抗侵染［1-5］。PTI相當于植物的第一層免疫防御反應，由宿主植物細胞表面的模式識別受體激活（Pattern recognition receptors，PRRs），病原菌入侵時，PRRs相應的識別PAMP（包括脂多糖、細菌鞭毛蛋白、脂肽和肽聚糖等）或DAMPs從而作出防御反應，抑制病原菌的初步侵染［6-7］。然而，病原菌面對植物的防御會見招拆招，利用特異的效應蛋白（Effector）來抑制植物的PTI，幫助病原在植物體內繁殖或擴散；相應地，針對病原物的effector又會誘發某些植物的ETI防御病原菌侵染，即植物的第二層免疫防御反應，主要由核苷酸結合的富含亮氨酸重復的受體（Nucleotide binding-leucine rich repeat receptors，NLRs）即抗性相關基因（Resistance gene，R）調控，直接或間接識別效應蛋白，誘發植物抗性，并觸發植物自身過敏反應，導致植物細胞自主凋亡，阻止病原菌的進一步擴散［2，4，7-8］。在上述病原菌 -植物的動態相互作用過程中，迫使植物相關機制的進化，快速而準確地激活/抑制防御反應相關基因的表達來建立局部和系統性抗性。

近年的研究表明，表觀遺傳在激活/抑制植物防御反應相關基因的表達方面起著非常重要的調控作用［9-10］。表觀遺傳主要指DNA的甲基化、組蛋白N端的甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化等共價修飾，小RNA也屬于這個范疇。它在不改變基因序列的情況下就可以調控植物防御相關基因的表達，迅速激活特定的防御反應（水楊酸、茉莉酸、乙烯信號傳遞途徑等）來對抗病原菌［11］。并且這些病原菌誘導形成的表觀修飾能夠遺傳給后代，增強防御能力［2，11-14］。

水稻和擬南芥分別是單子葉和雙子葉植物研究的重要模式植物，丁香假單胞桿菌番茄致病變種 DC3000［Pseudomonas syringaepv. tomato（Pst）DC3000］和白葉枯病原菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo）是最普遍和最具代表性的重要病原細菌。本文主要在已報道的科學試驗結果的基礎上，總結了表觀遺傳修飾在水稻/擬南芥防御兩種病原細菌入侵中的作用，重點闡明水稻/擬南芥的基因組DNA甲基化、組蛋白修飾以及小RNA在防御反應中的分子調控機理，以便更好地理解表觀遺傳修飾對病原細菌入侵的響應，為其他作物的表觀遺傳抗病研究提供理論參考。

1 DNA甲基化與抗病性

基因組DNA的表觀遺傳修飾主要是DNA甲基化，它是很多生物過程包括遺傳印跡、X染色體失活、細胞分化、基因沉默等的基礎，主要通過共價修飾調控基因的表達［5］。在植物中，生物基因組DNA胞嘧啶核苷酸上均能發生DNA的甲基化，主要是在CG，CHG和CHH（其中H可以是A、C或T）序列中的胞嘧啶上添加一個甲基，由DNA甲基轉移酶家族（DNA Methyltransferase，DnMT）催化完成［15］。植物中的DNA甲基轉移酶主要有：負責維持DNA甲基化的DNA甲基轉移酶1（DNA methyltransferase 1，MET1）和染色質甲基化酶（Chromomethylases，CMTs），它們根據親鏈上甲基化位點對已經完成復制的半甲基化DNA做相應的甲基化修飾；結構域重排甲基轉移酶2（Domains rearranged methyltransferase 2，DRM2），由RNA介導作用于基因組上的同源特異序列，不依賴DNA的復制，在完全去甲基化的位點上催化DNA序列從頭甲基化［3，15］。通常，基因組DNA的高度甲基化沉默基因的表達，而活躍表達的基因的啟動子是低甲基化的。

DNA甲基化不僅在基因表達、細胞分化以及系統發育過程中起著重要的調控作用，而且在植物對病原細菌的防御反應中也扮演著重要角色，一些生物逆境應答基因就是通過DNA的甲基化和去甲基化調控的［4，16］。早在 1975年，Guseinov和Vanyushin［16］就從生化水平上提出了植物可以通過改變基因組胞嘧啶甲基化狀態防御病原菌的入侵。目前，從分子水平上已有大量研究證實病原菌的侵染能誘導植物DNA甲基化動態變化，從而改變基因表達水平。通常基因組DNA的低甲基化程度激活植物防御反應。2006年，Pavet等［17］發現擬南芥被PstDC3000侵染后，其體內很多基因組序列變為低甲基化狀態。2012年，Matzke證實DNA甲基化基 因（MET1-3，DDC，DRM1-2，DRM2-2，CMT3-11）缺陷的擬南芥突變體被PstDC3000侵染后，同野生型相比對DC3000抗性增強，且多個甲基化基因同時敲除的突變體表現出更高的抗性［3，18-19］。說明基因組甲基化水平的降低能夠增強擬南芥對PstDC3000的抗性。此后又有研究報道，擬南芥表觀遺傳調節子延伸復合物亞基2（ELP2）是快速防御反應中重要的轉錄激活劑，而病程相關基因非表達子1（Nonexpressor of pathogenesis-related genes1，NPR1）是ELP2防御反應中的共激活劑；ELP2參與調節NPR1的基礎甲基化水平，兩者協同調控擬南芥對DC3000的防御反應。DC3000/avrRpt 2接種野生型和elp2突變體，發現elp2突變體因ELP2的缺失而無法調節病原菌應答基因NPR1基因DNA甲基化水平，表現為NPR1啟動子區的DNA甲基化水平同野生型相比較高且穩定，從而延遲了防御基因的表達。由此表明，elp2在改變病原菌誘導的DNA甲基化水平，參與調控防御基因表達有重要作用［3，19］（表1）。另外，RNA能夠通過RNA指導的DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation，RdDM）路徑參與DNA甲基化過程。在RdDM組分AGO4（Argonaute 4）蛋白突變的擬南芥中，基因組DNA甲基化程度降低，且對致病菌PstDC3000和含avrRpm1效應子的非致病菌更敏感［3，20］（表1）。說明RNA介導的DNA甲基化也參與植物防御反應。

此外，在植物體內還存在DNA去甲基化過程，由DNA糖基化酶催化的DNA去甲基酶家族完成［21-22］。目前，已鑒定的擬南芥中的DNA去甲基酶 有 DME（Demeter）、ROS1（Repressor of silencing1）也叫 DML1（DME-like 1）、DML 2（DME-like 2）和 DML3（DME-like 3）［3］。研究證實，PstDC3000侵染擬南芥ros1突變體后，其體內抗病基因（RMG1或At4g11170）啟動子中的轉座因子（AtREP 11）的胞嘧啶甲基化顯著增加，從而降低了該抗病基因的表達，顯示出對DC3000的敏感性增加（表1）。表明DNA去甲基化在擬南芥防御細菌入侵中起積極作用，特別是含轉座子啟動子的DNA去甲基化能夠增強植物抗病性［23］，正調控植物對病原細菌的抗性。

綜上所述，當植物遭遇病原細菌侵染時，基因組的DNA甲基化水平會降低，激活抗病防御反應相關基因的表達，從而增強植物的抗病能力。這個過程由DNA甲基轉移酶和去甲基酶基因共同調控。

2 組蛋白翻譯后修飾與抗病性

基因組DNA和組蛋白（包括H2A，H2B，H3和H4四個亞單位）能夠有組織的包裝成核小體，是染色質的基本組成單位。核小體中的任何一個核心組蛋白都可能發生包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化、ADP-核糖基化等在內的表觀遺傳修飾，改變染色體結構，從而激活/抑制基因的表達［24］。一般而言，H3第4位和36位賴氨酸（H3K4和H3K36）的甲基化和H3 與H4高乙酰化修飾激活基因的表達；H3第9位和27位賴氨酸（H3K9和H3K27）的甲基化和H3 與H4低乙酰化修飾抑制基因的表達。

目前，病原細菌能誘導水稻/擬南芥組蛋白N端的氨基酸殘基發生可逆的共價修飾，在其防御病原菌入侵過程中有非常重要的作用。研究得比較清楚的是賴氨酸殘基的甲基化/去甲基化修飾，乙酰化/去乙酰化，絲氨酸和蘇氨酸的泛素化修飾等在水稻/擬南芥防御病原菌入侵過程中的表觀遺傳調控功能［25］。

2.1 組蛋白甲基化/去甲基化修飾

組蛋白甲基化修飾由含進化上保守的SET結構域的組蛋白甲基轉移酶（Histone methyltransferases，HMTs）調節。病原細菌誘導的組蛋白甲基化修飾能夠激活宿主的細胞信號級聯反應，激活/抑制防御基因的表達，從而增強/減弱植株的抗性。最近的研究表明，擬南芥的H3K4組蛋白甲基轉移酶ATX1對基礎抗病性反應起重要作用。ATX1通過調節WRKY70（水楊酸和茉莉酸信號途徑的關鍵轉錄因子）啟動子的H3K4的甲基化來激活WRKY70的表達，從而上調水楊酸（Salicylic acid，SA）信號途徑基因PR1的表達以及下調茉莉酸（Jasmonic Acid，JA）信號途徑基因THI2.1的表達，參與到擬南芥對PstDC3000 侵染的防御反應［26-27］（表 1）。說明依賴ATX1的H3K4甲基化修飾參與SA和JA兩條抗病信號通路，協同調控抗病，是擬南芥防御PstDC3000侵染不可或缺的調控因子。

SDG8，H3K36組蛋白甲基轉移酶，通過介導RPS4-like R基因（LAZ5）位點的H3K36三甲基化，上調LAZ5基因的表達，在擬南芥對抗PstDC3000攻擊的天然免疫中起正調控作用（表1）。另有報道，SDG8通過介導ERF1、MYC2、PDF1.2a和VSP2等JA/ ET信號途徑基因位點，誘導這些基因的快速轉錄，增強擬南芥對真菌（黑斑病菌和灰霉病菌）的抗性［28］。這充分表明依賴SDG8的H3K36甲基化修飾能同時正調控對細菌及真菌的防御反應，其作用具有非特異性。

表1 已報道的DNA甲基化和組蛋白修飾在水稻/擬南芥防御病原細菌中的調控作用

組蛋白的甲基化轉移酶通過修飾重要抗病信號途徑（SA/JA等）基因或直接修飾R基因來激活或抑制其表達，從而調控水稻/擬南芥對病原細菌的防御方應。組蛋白去甲基化和甲基化修飾是互逆的動態過程，也參與到水稻/擬南芥防御病原細菌入侵的過程中，起到非常重要的調控作用。水稻jmjC去甲基化酶JMJ705特異地去除H3K27位點的甲基化修飾；白葉枯病原菌侵染水稻后，能誘導JMJ705的表達［29］；超量表達的JMJ705可激活水稻抗病防御反應相關基因的表達，增強水稻對Xoo的抗性。相應地，抑制表達的JMJ705會減弱對Xoo的抗性［29］。實驗還證明，JMJ705是通過去除JA信號途徑相關基因的H3K27三甲基化修飾來增強它們的表達，從而提高水稻的抗性［3］（表1）。另外，研究還證實水稻jmjC去甲基化酶基因家族另一個成員JMJ704也參與到水稻對Xoo防御反應。JMJ704能被Xoo誘導表達；且該基因的兩個等位突變體均表現出對Xoo的抗性減弱［30］（表1）。但是，與JMJ705的作用機制不同，JMJ704通過降低抗病負調控因子的H3K4的甲基化水平，抑制抗病負調控因子的表達，從而實現水稻對Xoo的正調節；而JMJ705則是通過上調抗病正調控因子的表達增強水稻對Xoo的抗性。這一結果表明，jmjC基因家族對水稻白葉枯的抗性存在著增強抗病基因表達和減弱感病基因表達的雙向調控通路。

目前所證實的無論是H3K4、H3K27，還是H3K36位點的甲基化/去甲基化都是通過上調SA/JA信號途徑的基因或R基因的表達來正調控對PstDC3000和Xoo的防御反應。這些修飾之間有沒有協同和拮抗的作用；對其他病原菌的作用又如何；H3K4、H3K27、H3K36和H3K9以及精氨酸位點的甲基化/去甲基化對PstDC3000和Xoo的作用模式是否一樣，這些具體的問題都有待我們去進一步探索和研究。

2.2 組蛋白乙酰化/去乙酰化修飾

與組蛋白去甲基化和甲基化修飾類似，組蛋白的乙酰化和去乙酰化也是互逆的動態過程，由組蛋白乙酰轉移酶（Histone acetyltransferases，HATs）和去乙酰化酶（Histone deacetyltransferases，HDAs）共同調節組蛋白末端的賴氨酸殘基的乙酰化水平。通常，組蛋白乙酰化激活基因轉錄，而組蛋白去乙酰化既可激活轉錄又可抑制轉錄［29，31-32］。在水稻/擬南芥中，HATs和HDAs除調控生長發育基因的表達外，還與抗病性有關［3］。

ELP3是延伸復合物的催化亞單位，其C端具有HAT結構域，N端具有富含半胱氨酸基序，具HAT活性，能乙酰化4種組蛋白，在ELP3參與的免疫反應中至關重要［33］。elp3功能缺失突變體感染PstDC3000后，會延遲誘導防御基因（包括PR1，PR5和WRKY18）表達［34］（表 1）。與 ELP3 類似，ELP2是免疫反應的共激活劑，通過與NPR1相互作用參與植物防御反應。與野生型植物相比，elp2突變體中的NPR1、PR2、PR5、EDS1和 PAD4中的H3K9/14乙酰化水平較低，這可部分解釋elp2誘導的組蛋白乙酰化與防御基因表達有關［19］（表1）。

植物的HDAs可分為RPD3/HDA1、SIR2（Silent information regulator 2）和 HD2（Histone deacetylase-II）3大類型。組蛋白去乙酰化修飾在抗病方面的作用最早要追溯到對HDA1型去乙酰化酶HDA19（Histone Deacetylase 19，HDA19）的研究。HDA19與植物的多個生長發育過程相關。在擬南芥中，HDA19參與SA介導的防御反應［35］。HDA19活性的喪失使SA的含量增多，SA信號傳遞途徑基因（如病程相關基因PR1、PR4和PR5）表達增強，表現為對P. syringaepv.tomatoDC3000抗性增強［36-37］（表1）。另一方面，研究證實HDA19參與激活擬南芥中JA介導的防御反應。HDA19的超量表達促使JA信號途徑基因ERF1的表達上調，增強擬南芥對黑斑病菌（Alternaria brassicicola）的抗性（表1）。此外，擬南芥中由P. syringae誘導的HDA19抑制WRKY38和WRKY62的轉錄活性，其中WRKY38和WRKY62是基礎防御反應PR基因的負調節子［38］（表1）。擬南芥SIR2型去乙酰化酶SRT2通過抑制PAD4，EDS5和SID2等SA信號途徑基因的表達負調控擬南芥對番茄丁香假單胞菌（Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000）的防御反應［39］（表 1）。

水稻中的HD2型去乙酰化酶HDT701是天然免疫的負調節子調控水稻免疫反應。HDT701超表達的轉基因水稻對稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）和白葉枯病菌（Xoo）更敏感且組蛋白H4乙酰化水平下降；相應地HDT701的缺失突變株對兩種病原菌抗性增強。進一步實驗證明，水稻中的擬南芥鞭毛蛋白受體激酶（Receptor kinase flagellin sensing 2，FLS2）同源蛋白OsFLS2乙酰化水平的增強，以及防御相關基因MAPK6和WRKY53的表達和活性氧的爆發會提高水稻抗性［40］（表1）。綜上所述，乙酰化酶通過乙酰化相關防御基因來激活其表達，從而正調控水稻/擬南芥對病原細菌的入侵；不論哪一類型的去乙酰化酶，一般而言都是通過對SA和JA等重要抗病信號途徑和防御反應相關基因的去乙酰化，抑制其表達來負調控水稻/擬南芥對病原細菌的入侵。但是也有例外，HDA19可以增強JA/ET信號途徑基因ERF1的表達，正調控擬南芥對黑斑病菌的防御反應。因此，每一種乙酰化/去乙酰化修飾對病原菌入侵的作用都需要逐個研究。

2.3 組蛋白泛素化修飾

組蛋白泛素化主要發生在組蛋白H2A和H2B上，是自由的泛素分子或泛素鏈通過依賴于ATP的蛋白酶體系結合到特定底物的過程。分為單泛素化和多泛素化兩種類型，由泛素激活酶（E1）、泛素結合酶（E2）和泛素連接酶（E3）催化實現［41］，能夠激活或抑制轉錄。在擬南芥中，組蛋白H2B單泛素化（Histone H2B monoubiquitination，H2Bub） 由 兩個E3泛素連接酶HUB1（Histone monoubiquitibation 1）和 HUB2（Histone monoubiquitibation 2）催化形成［42］。通常，H2Bub與轉錄激活相關。

有研究表明，HUB1和HUB2調節R基因SNC1（Suppressor ofnpr1-1，constitutive1）和RPP4（Resistance to peronospora parasitica 4）的表達。HUB1通過調節SNC1/RPP4位點H2B單泛素化來調控SNC1/RPP4表達［42］。野生型植株感染PstDC3000后，會適度上調SNC1，同時SNC1的組蛋白H2B單泛素化水平增高。而在HUB1或HUB2功能缺失的突變體中，則會減少SNC1的上調。表明病原菌誘導的抗性基因SNC1的表達依賴 HUB1 和 HUB2［42］（表 1）。

組蛋白泛素化不但直接激活R基因的表達，增強抗病性激活，還廣泛參與包括JA、SA、ET、效應因子觸發的免疫反應ETI以及病原相關分子模式觸發的免疫PTI等在內的防衛信號傳遞過程。

3 小RNA與抗病性

動植物體內有一類非編碼的小RNA（Small RNA），能夠調控mRNA降解，抑制轉錄、翻譯，影響染色質修飾，是重要調控因子，參與調節包括葉片發育、開花時間、胚胎形成和防御反應等多個生物過程［44-45］。植物內源小RNA根據生物合成途徑可分為miRNA（microRNA）和siRNA（short interfering RNA）兩類。miRNA是20-22 nt的單鏈RNA，與靶mRNA高度互補，通過封閉mRNA抑制基因的表達。siRNA是由雙鏈RNA前體加工而來，主要通過DNA甲基化、組蛋白修飾、mRNA降解和翻譯抑制沉默基因表達［44］。

擬南芥miR393是植物中最早發現的miRNA分子，通過負調控生長素（Auxin）信號通路在植物PTI中起重要作用［2，46］。病原細菌侵染植物后，細菌多肽f1g22會誘導宿主植物miR393表達，使其靶分子auxin的受體TIR（Toll/interleukin-1 receptor）降解，auxin信號通路下調，從而抑制細菌增殖（表1）［46］。tir突變植株對PstDC3000敏感性增強，表明miR393在植物防御病原菌中起重要作用［47］。有研究報道，丁香假單胞菌的f1g22誘導的PTI，通過miR160a負調控、miR398b和miR773 正調控胼胝質沉積，參與擬南芥對細菌病害的防御反應［2，20］。此外，Fahlgren等［48］以PstDC3000hrcC侵染擬南芥葉片1 h或3 h，經小RNA表達譜分析發現，miR393、miRl67和miRl60均超表達，且它們都通過靶向auxin受體基因或auxin應答因子負調控auxin信號，抑制細菌增殖。2017年，Chow HT等［45］報道了一個非保守的小RNA——miR163，它與小分子甲基轉移酶（Small-molecule methyltransferases，MTs）有關，參與調節植物防御反應。早期有報道，其在擬南芥中作為防御反應的負調控因子。后來發現，當其與組蛋白脫乙酰酶（或其他靶標，如PXMT1和FAMT）協調作用時，又能夠提高植物抗性，抵御Pst的侵染。

siRNA也可以調控植物免疫，具有avrRpt2效應子的PstDC3000侵染植株能特異性誘導擬南芥中天然反義轉錄本來源的siRNA［snatural antisense transcript（NAT）-associated siRNAs，nat-siRNAs］和長siRNA（lsiRNA-1），從而抑制其靶蛋白PPRL（ETI的負調控子），識別病原菌衍生效應子并激活ETI，起到防御病原菌的作用［2，47，49］（表 1）。上述研究結果表明，植物病原菌入侵宿主植物后，產生的效應子可誘導植物中siRNA與特定抗性通路中的負調控因子作用而使之下調，進而激活ETI免疫反應。此外，siRNA還可通過介導DNA甲基化和組蛋白修飾誘導基因轉錄沉默［47，50］。

小RNA介導的基因沉默是植物抵抗病原細菌非常重要的調節機制之一，但是其調控植物免疫反應是一個復雜的過程。目前還需要進一步研究其功能，挖掘更多與抗病相關的小RNA并解析其機理，拓展植物病理學的研究。

4 小結

近年來表觀遺傳學已經成為生命科學研究關注的熱點。植物對病原細菌的免疫防御反應有嚴格且復雜的調控機制。越來越多的研究表明，表觀遺傳修飾在水稻/擬南芥對病原細菌入侵的防御反應中起著關鍵的調控作用。表觀遺傳修飾通過激活/抑制宿主R基因、重要抗病信號途徑（SA/JS等）以及防御反應相關基因的表達，從而調控水稻和擬南芥對病原細菌的抗性。

目前，我們對表觀遺傳修飾調控宿主的抗病防御反應過程已有初步的了解，但所認知的只是單個的表觀遺傳修飾的調控功能，眾多表觀遺傳修飾在植物免疫防御中的聯系及相互作用機制尚不明確；不同類型病原菌誘導的表觀遺傳修飾的范圍和種類仍有待闡明；哪些與植物免疫力相關的表觀遺傳修飾可以傳遞給后代，以及這些修飾在病原菌共存的選擇性壓力下的穩定性都有待進一步探索。另外一方面，大量研究證實表觀遺傳修飾在植物的生長、發育和抗逆過程中發揮著重要的作用，是植物生命周期各個過程不可或缺的調控因子。如果表觀遺傳修飾在抗病防御反應中作用顯著，是不是會削弱它在其他生長發育過程中的作用，植物的其他性狀是否會受到影響，其如何有效協調植物各個生命過程？

今后，我們應深入挖掘表觀遺傳調控植物抗病性相關基因并分析其抗病調控功能，從基因組水平選育抗病品種；充分利用高通量測序從整體水平研究表觀遺傳修飾與各類病原菌的互作，與宿主植物免疫反應的機制；從遺傳、分子、生化等方面深入探究表觀遺傳修飾在調控抗病和植物其它性狀之間的協調機制；DNA甲基化是表觀遺傳中非常重要的一個過程，通常與組蛋白甲基化、乙酰化等多個表觀途徑密切相關，各表觀遺傳途徑之間的相互作用還不明確；siRNA和組蛋白甲基化均可介導DNA甲基化，但是其參與免疫反應的機制還需進一步明確，它們是直接還是間接作用于抗病相關基因也還不清楚；其他多個表觀遺傳修飾是協同或拮抗作用調控植物免疫反應需要我們進一步研究。此外，表觀遺傳修飾能夠遺傳給后代，但傳遞機制還不清楚，如何利用這種機制調控和提高植物的抗性還有待研究，且可以利用跨世代遺傳的特性改變植物的表觀修飾為抗病育種提供新思路。這不僅有助于我們從理論上了解表觀遺傳學對植物抗病的分子調節機制，挖掘更多的表觀遺傳抗病性基因，而且在應用上可以為抗病遺傳育種提供優良基因資源，培育高抗優質品種，減少糧食損失，保障國家糧食安全。

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