致病疫霉RXLR效應蛋白相關研究進展

王洪洋 秦麗娟 唐唯 田振東

（1. 云南師范大學生命科學學院，昆明 650500；2. 云南省芒市植保植檢站，芒市 678400；3. 農業部馬鈴薯生物學與生物技術重點實驗室華中農業大學，武漢 430070）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是繼水稻、小麥、玉米之后全球第四大重要糧食作物，在全世界158個國家廣泛種植（http://www.fao.org/statistics/zh/）。由致 病疫霉 菌（Phytophthora infestans（Mont.）de Bary）引起的馬鈴薯晚疫病嚴重威脅著全球馬鈴薯生產安全［1］。在長期自然進化中，馬鈴薯形成了一套有效的免疫體系來抵擋各種病原菌人侵。同時病原菌為了侵染寄主，也形成了多種機制來克服馬鈴薯的防御反應。P. infestans能夠在馬鈴薯中成功侵染并繁衍的一個關鍵因素就是通過吸器組織向植物細胞內分泌一類具有“RXLR”保守結構的效應蛋白，抑制由病原菌的病原相關分子模式分子（Pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）激發的免疫反應（PAMP-triggered immunity，PTI），促使植物更易感病［2-6］。然而馬鈴薯則進化出NB-LRR類抗病基因（Resistance gene toP. infestans，Rpi），其編碼蛋白直接或間接特異識別P. infestans中RXLR效應蛋白，產生效應子激發免疫反應（Effector-triggered immunity，ETI）［7-8］。這些被 Rpi蛋白特異識別的RXLR效應蛋白稱為無毒蛋白（Avirulence protein，AVR）。在馬鈴薯與P. infestans這一復雜的防御與侵染互作過程中，RXLR效應蛋白起著關鍵的作用。本文以RXLR效應蛋白為切入點，綜述了P.infestans的RXLR效應子相關研究進展，以期為RXLR效應蛋白今后研究及P. infestans與馬鈴薯的互作機制研究提供較為系統而全面的參考信息。

1 致病疫霉RXLR效應蛋白結構及基本功能

病原菌效應蛋白及其功能研究是寄主與病原菌互作研究領域的熱點。真核病原菌分泌效應蛋白途徑不同于原核細菌的Ⅲ型分泌系統，可能主要是通過內質網-高爾基（ER-Golgi）的蛋白分泌系統［9］。病原菌效應子必須被分泌并轉運到寄主細胞的特定區域才能發揮致病作用。根據效應子在植物細胞的不同作用位置，效應子一般分為胞質效應蛋白（Cytoplasmic effector）和質外體效應蛋白（Apoplastic effector）。致病疫霉RXLR胞質效應蛋白既可以作為致病因子促進寄主植物感病，又可以作為無毒因子被抗病基因編碼蛋白識別激發寄主防御反應［7］。RXLR效應蛋白的主要特征是其N端含有一個15-25個疏水性氨基酸殘基組成的信號肽，信號肽后是保守的Arg-X-Leu-Arg（RXLR，X代表任意氨基酸）結構域，以及多態性的C端效應子功能域［10］。N端信號肽和RXLR結構域與效應子分泌和轉運進入寄主細胞有關，而多態性的C端功能域則是病原菌用來調控寄主防御反應和通過快速進化從而躲避寄主抗病蛋白識別的關鍵區域［11］。

隨著基因組測序技術的飛快發展，2009年完成了P. infestans菌株T30-4全基因組的測序和組裝，研究發現P. infestans全基因組有240 Mb，預測有17 797個編碼基因，其中包含563個RXLR效應子基因［12］。Raffaele等［13］對P. infestans的基因組骨架和基因表達譜進行分析發現，P. infestans基因組中有540個RXLR效應子基因，且其中有97.4%都位于基因組轉座子區，變異率非常高，這些快速變異的RXLR效應子有助于P. infestans快速的適應寄主植物。Cooke等［14］對P. infestans的A2交配型的生理小種06_3928A進行了全基因組測序，并與參考菌株T30-4全基因組比較分析發現，405個RXLR效應子基因SNP標記中存在278個（69%）非同義替換，作者認為這些多態型的RXLR效應蛋白可能是導致P. infestans基因型13_A2菌株快速發展成為英國優勢致病菌株的原因。RXLR效應蛋白的快速進化對P. infestans克服已有馬鈴薯抗病基因起著十分重要的作用。

2 RXLR效應蛋白的毒性功能

已有研究顯示P. infestans能夠分泌RXLR效應子到寄主細胞內以干擾植物免疫反應，RXLR效應子扮演著毒性因子的角色，但是目前絕大多數效應子如何發揮其毒性功能還不清楚。通過轉錄組分析，研究者發現至少79個RXLR效應子基因在P.infestans接種寄主后2-3 d內表達量顯著增高［12］。這些效應子理論上在抑制植物PTI免疫、調控轉錄因子、蛋白降解、信號傳導、泛素化等方面發揮著重要功能。

目前，部分P. infestans侵染前期上調表達的RXLR效應子基因亞細胞定位、寄主標靶及其功能已有研究報道（表 1）。McLellan等［2］研究發現，效應子PITG_03192的寄主靶標是馬鈴薯轉錄因 子 StNTP1和 StNTP2，PITG_03192抑 制 StNTP1和StNTP2從內質網向細胞核的轉運，從而促進P.infestans侵染。絲裂原活化蛋白激酶在植物免疫信號傳導途徑中起著重要作用［15］。King等［3］報道效應子PexRD2可以特異結合并抑制植物絲裂原活化蛋白激酶MAPKKKε的激酶活性，進而干擾植物免疫相關信號傳導，致使植物更容易感?。?］。P.infestans基因組中存在數百個RXLR效應子基因，研究發現RXLR效應子具有功能冗余性，一部分RXLR效應子執行同樣的功能。Zheng等［4］通過在番茄原生質體中表達33個致病疫霉RXLR效應子，結果發現 PITG_04097、PITG_04145、PITG_06087、PITG_09585、PITG_13628、PITG_13959、PITG_18215和PITG_20303等8個效應子可以抑制病原相關分子模式flg22激發的早期PTI免疫反應，同樣在番茄上有3個RXLR效應子（PITG_13628，PITG_13959，PITG_18215）能夠抑制番茄中MAP激酶活性，干擾植物抗病信號傳導。Dagdas等［16］利用免疫共沉淀技術在本式煙草上篩選到RXLR效應子PexRD54（PITG_09316）的互作蛋白，發現PexRD54與植物自噬蛋白ATG8CL互作并加速細胞內自噬體的形成，同時大大減弱了自噬運輸受體Joka2介導的免疫反應。Wang等［17］發現在本氏煙草中瞬時表達細胞核（nucleus）定位RXLR效應子PITG_22798可以激發細胞死亡，核定位突變后PITG_22798不能誘導產生細胞死亡。該細胞死亡依賴SGT1介導的信號傳導途徑，并可以被P. infestans無毒蛋白AVR3b抑制。

植物體內存在一類蛋白，能夠被病原菌利用并促進病原菌侵染，即感病因子（Susceptibility factor，S factor）。在寄主植物中沉默或突變感病因子有助于增強植物抗病性［18-20］。Wang等［21］研究首次發現P. infestans細胞核定位效應子PITG_04089可以通過與感病因子RNA結合蛋白StKRBP1互作并調控StKRBP1的積累來促進P. infestans侵染。另外作者還發現細胞核定位對于效應子PITG_04089發揮毒性功能至關重要。Boevink等［6］發現RXLR效應子PITG_04314雖然可以與植物蛋白磷酸酶PP1c催化亞基產生互作，并促進PP1c從核仁轉運到核質，但是PITG_04314并沒有影響PP1c的磷酸酶活性。研究者推測效應子PITG_04314是通過與PP1c發生互作形成PITG_04314- PP1c復合體全酶形式負調控植物防御反應。在馬鈴薯中超量表達PITG_04314基因，JA-和SA-響應報告基因明顯表達下調。同樣效應子PITG_04314發揮毒性功能與其細胞核定位關聯。Yang等［5］研究發現RXLR效應子PITG_02860可以與感病因子StNRL1互作調控植物免疫反應，另外只有當PITG_02860基因在細胞質（cytoplasm）中表達時，PITG_02860才能抑制INF1（P. infestans的PAMP）介導的HR反應和促進植物感病。

3 無毒蛋白

表1 已報道毒性RXLR效應子亞細胞定位及寄主靶標

目前報道的所有P. infestans無毒蛋白（AVR）均屬于RXLR類效應蛋白，同樣具有N端信號肽、RXLR結構域和C-端功能域，無毒基因具有在P.infestans侵染前期上調表達的特點［10］。P. infestans的AVR基因與馬鈴薯Rpi基因間的互作識別符合“基因對基因”模型［22］。當這些AVR蛋白進入細胞內后，會抑制病原菌PAMP激發的PTI免疫途徑，然而當寄主細胞內有對應的Rpi基因存在時，Rpi蛋白會特異識別這些AVR蛋白，從而激發ETI免疫途徑，使馬鈴薯產生抗病性。近年來，關于P. infestans的AVR基因的克隆、亞細胞定位、寄主靶標及功能等方面的研究已有很好的進展（表2）。

3.1 無毒基因的功能研究

目前，已被克隆的P. infestans的AVR基因已有10 個， 即AVR1［23］、AVR2［24］、AVR3a［25］、AVR3-b［26］、AVR4［27］、AVR-blb1［28］、AVR-blb2［29］、AVR-vnt1［30］、AVRSmira1［31］和AVRSmira2/AVR8［31-32］。

AVR3a是第一個從P. infestans中克隆到的RXLR類無毒基因［25］。研究發現AVR3a可以與植物E3泛素連接酶CMPG1和GTP酶DRP2互作，從而抑制INF1和flg22介導的PTI免疫反應，促進P.infestans侵染植物［33-34］。Rpi-R3a和AVR3a的識別互作模式目前尚不清楚。雖然AVR3a和Rpi-R3a可以共定位在植物細胞質內涵體中激發HR反應，但是酵母雙雜交和免疫共沉淀均不能證明AVR3a和Rpi-R3a直接互作［35］。另外沉默CMPG1不影響Rpi-R3a識別AVR3a激發HR反應，說明CMPG1不是Rpi-R3a識別AVR3a信號途徑中的關鍵因子［36］。

表2 已報道的P. infestans無毒基因

研究發現，只有當AVR1和Rpi-R1均在細胞核中表達時，Rpi-R1才能識別AVR1并激發HR反應。當AVR1在細胞質中表達時，可以抑制效應子CRN2介導的細胞死亡反應［23］。通過酵母雙雜交和免疫共沉淀發現AVR1與蛋白復合體exocyst的一個亞基Sec5互作，可能干擾植物防御中細胞囊泡運輸途徑。AVR1通過抑制Sec5從而導致病程相關蛋白PR-1分泌減少和降低P. infestans接種點處胼胝質積累，使植物免疫能力下降。Sec5是否在Rpi-R1識別AVR1反應途徑中扮演重要角色有待進一步研究［37］。

AVR2和AVR-blb2主要在植物細胞質膜（Plasma membrane，PM）和P. infestans侵染點處吸器組織內表達［24，38-39］。AVR-blb2可通過與植物防御相關木瓜蛋白酶C14互作，抑制其在質外體內積累，從而干擾植物防御反應［38］。另外，研究發現Rpi-blb2識別AVR-blb2激發的HR反應依賴SGT1，不需要水楊酸、茉莉酸或者乙烯介導的信號傳導途徑［40］。馬鈴薯磷酸酶StBSL1蛋白參與油菜素內脂信號傳導，調控生長和發育。研究發現P. infestans無毒蛋白AVR2與StBSL1形成復合體進而被抗病蛋白Rpi-R2識別、激發HR反應，Rpi-R2和AVR2識別免疫反應符合“警戒”假說［24］。基因芯片分析發現，表達AVR2的轉基因馬鈴薯中參與油菜素內酯信號傳導的轉錄因子StCHL1組成型表達，瞬時超量表達StCHL1和AVR2促進植物感病，沉默StCHL1基因則增強馬鈴薯對P. infestans的抵抗能力。研究者指出，AVR2是通過激活植物油菜素內酯信號傳導間接抑制INF1介導植物PTI免疫反應，促進植物感病［41］。

AVR3b定位在植物細胞質和質膜上，可以抑制flg22介導的早期PTI免疫反應和番茄中MAP激酶活性，干擾植物抗病信號傳導，促進P. infestans侵染［4］。目前尚未發現AVR3b在植物體內的寄主靶標蛋白，其致病分子機理有待進一步研究。PVX-agroinfection分析發現AVR4可以被含有Rpi-R4的馬鈴薯材料識別并激發HR反應，其C-端W基序是蛋白識別的關鍵區域［42］。同樣有關AVR4的寄主靶標蛋白未見有報道。

在P. infestans無毒蛋白（AVR）和馬鈴薯抗晚疫病蛋白（Rpi）互作識別模式研究中，AVR-blb1（IPI-O1）與Rpi-blb1符合直接互作識別模式。研究發現Rpi-blb1中CC結構域是與AVR-blb1互作的重要結構域。AVR-blb1蛋白結構中第129位亮氨酸對Rpi-blb1識別AVR-blb1激發HR起到關鍵作用，突變第129位亮氨酸（L129P）則導致Rpi-blb1不能與AVR-blb1互作，也不能產生HR。另外AVR-blb1的毒性蛋白形式IPI-O4也可以與Rpi-blb1直接互作。研究者指出P. infestans的AVR-blb1毒性形式IPI-O4通過與IPI-O1競爭互作Rpi-blb1，使Rpiblb1處于非激活狀態，進而大大減弱植物ETI免疫反應［43］。另外，研究發現，AVR-blb1還可以通過細胞黏附基序RGD與擬南芥中的凝集素受體激酶LecRK-I.9發生互作。超量表達LecRK-I.9增強擬南芥對P. brassicae的抗性，突變LecRK-I.9和超量表達AVR-blb1導致病原菌接種點處胼胝質的積累減弱，促使擬南芥感病［44］。

AVR-vnt1可以被Rpi-vnt1和Rpi-phu1識別并激發抗性反應［30，45］。研究發現P. infestans毒性生理小種（MP324x和MP1580）在無Rpi-phu1的馬鈴薯中侵染時還是會表達AVR-vnt1，只是在含Rpi-phu1的馬鈴薯上會通過基因沉默等方式不表達AVR-vnt1以躲避Rpi-phu1等抗病蛋白的識別以達到致病目的［45］。另外，通過效應子組學策略研究發現，部分RXLR效應子可以作為候選無毒蛋白被辣椒、龍葵識別并激發HR反應，參與了P. infestans的非寄主抗性免疫途徑［46-47］。

3.2 無毒基因的進化與變異

P. infestans生理小種的變化和區域分布是影響馬鈴薯品種抗病性能否持久的主要因素之一，了解AVR基因在小種間的變化不僅有助于揭示AVR基因進化變異的過程，同時也可以檢測生理小種的變化，為選育抗病品種以及生產中抗病品種/抗源合理利用提供依據。P. infestans數百個RXLR效應子基因中，AVR基因可以通過基因缺失、序列多態性或者轉錄調控表達等變異機制來幫助P. infestans躲避對應抗病蛋白的識別（表3）。

AVR基因缺失，主要表現在基因編碼序列的全部與部分缺失，基因上下游序列的全部與部分缺失［51］。通過與參考菌株T30-4基因組比對，Pais等［52］發現P. infestans菌株 P13527中有 62個基因缺失，菌株P13626中有60個基因缺失。AVR1、AVR2、AVR3b和AVR-blb1在P. infestans不同生理小種中均存在基因缺失［23，53-55］。研究發現，能夠克服Rpi-R1的一個P. infestans毒性菌株中缺失AVR1基因，但是在相同位置上存在一個AVR1-like基因。AVR1-like蛋白同樣是RXLR效應子，AVR1-like的C端缺失38個氨基酸，導致了AVR1-like不能被Rpi-R1識別［23］。通過在29個P. infestans生理小種中擴增AVR2基因，測序分析發現12個克服Rpi-R2的毒性菌株中有9個菌株缺失AVR2，在剩余3株毒性菌株和17株無毒菌株中AVR2存在序列多態性變異。另外在毒性菌株中克隆出AVR2-like，經氨基酸序列比對發現AVR2-like與AVR2存在13個氨基酸差異，且AVR2-like不能被Rpi-R2識別。研究者指出毒性P. infestans菌株中AVR2主要通過缺失、差異表達及序列多態性變異逃避Rpi-R2識別致使植物感病［53］。對多個P. infestans菌株中編碼的AVR-blb1（IPI-O）基因家族進行測序與分析，發現16種IPI-O蛋白變異型。根據氨基酸序列差異比對，將這16個差異蛋白可分成3組，其中第一組和第二組的變異型可以被Rpi-blb1識別，第三組的IPI-O4不能被Rpi-blb1識別，而且還與IPI-O1競爭互作Rpi-blb1，從而阻斷 Rpi-blb1 介導的抗病免疫反應［43，54，56］。

基因序列多態性包括堿基序列多態性、點突變等。AVR3a在P. infestans毒性菌株主要通過氨基酸點突變變異成毒性基因，毒性基因和無毒基因序列的差異主要在3個氨基酸位點，其中一個位于信號肽，另外兩個位于C端功能域。攜帶 Avr3aC19K80I103的P. infestans菌株對于含有Rpi-R3a馬鈴薯表現無毒性，而攜帶Avr3aS19E80M103菌株表現為毒性。研究表明AVR3a蛋白序列中第80位、103位的氨基酸對Rpi-R3a識別AVR3a具有重要作用［25］。目前發現AVR4的毒性形態主要是發生了移碼突變，導致基因短截，從而逃避了抗病蛋白的識別［27］。利用基于SNP策略對來自23個馬鈴薯主產國家采集的352株P. infestans菌株進行分析，研究發現AVR-blb2基因家族的多態性很高，且第69位氨基酸的點突變（F69I）對Rpi-blb2識別激活具有關鍵作用［57］。Stefańczyk 等［45］對 4 個P. infestans強致病生理小種中AVR-smira1基因進行擴增和測序，結果發現AVR-smira1在這4個小種中均有非同義突變。

病原菌中無毒基因選擇性表達也是毒性變異的一種策略［58］。Pais等［52］通過對P. infestans基因組和基因表達差異分析發現，17個基因在P13626菌株中不表達，AVR-vnt1是其中之一，在含有Rpivnt1.1的轉基因馬鈴薯上接種P13626表現感病。研究者認為菌株P13626中AVR-vnt1未轉錄表達避開了寄主Rpi-vnt1.1的識別而促進植物感病。

表3 無毒基因與抗病基因的互作模式及其在毒性小種中的變異形式

4 展望

RXLR效應蛋白在致病疫霉與寄主互作中起著關鍵作用。一方面，RXLR效應蛋白作為無毒蛋白被寄主抗病蛋白識別激發植物免疫反應；另一方面，RXLR效應蛋白作為致病疫霉抑制寄主免疫應答的關鍵武器，促進植物感?。?0］。通過對RXLR效應蛋白功能及其作用機制的研究有助于進一步深入了解致病疫霉與寄主間互作機制，從理論上指導探索晚疫病防治的新策略和技術。

4.1 RXLR效應蛋白的轉運機制

卵菌分泌效應蛋白途徑不同于原核細菌的Ⅲ型分泌系統，可能主要是通過內質網-高爾基（ERGolgi）的蛋白分泌系統［9］。基于卵菌基因組的研究表明，卵菌基因組中有一類數目眾多的編碼帶保守RXLR序列的分泌蛋白基因［12］。RXLR效應子如何被分泌轉運到植物細胞內從而調節寄主代謝和免疫反應呢？Kale等［61］研究RXLR效應子轉運機制主要是通過RXLR或RXLR-like基序與植物細胞膜3-磷酸磷脂酰肌醇分子（PI3P）結合而進入植物細胞內。但這一結論并不能適用于所有RXLR效應蛋白，如效應子AVR3a和AVR1d均是C端效應子功能域與磷脂類分子結合，而不是RXLR結構域［62-63］。Wawra等［64］發現AVR3a在被分泌、轉運到植物細胞前，其RXLR基序就已經被切除，研究表明RXLR基序在AVR3a蛋白修飾和分泌方面起到一定作用，但并沒有直接參與AVR3a轉運到植物細胞的過程。Ve等［65］證明亞麻銹菌的無毒蛋白AVR-M轉運進入細胞內需要N-疏水區域，而不需要可以與3-磷酸磷脂酰肌醇分子結合的C-端CC結構域。Wang等［66］發現RXLR效應子PITG_04314與質外體效應子EPIC1在P. infestans體內的分泌途徑不同，即質外體效應子EPIC1是通過內質網-高爾基（ER-Golgi）的蛋白分泌系統，而RXLR效應子PITG_04314則是通過另外一種特殊分泌系統。另外，有的RXLR效應子不依賴病原菌編碼機制也可以自主地進入植物細胞內，如AVR1b［67］。RXLR效應子的轉運過程非常復雜，還需要更多的研究來揭示RXLR效應蛋白是如何被轉運到寄主細胞中的。

4.2 RXLR效應蛋白的靶標蛋白功能解析

致病疫霉基因組中存在數百個編碼RXLR效應子的基因，這些效應子進入寄主細胞后通過與寄主靶標蛋白結合來調控寄主免疫應答反應［39］。有些RXLR效應子靶標蛋白對寄主抗性起正調控作用， 如 Sec5［37］，C14［38］，LecRK-I.9［44］等， 在 寄主中增強此類基因的表達會提高抗性；有些靶標對寄主抗性起負調控作用，如 StNRL1［5］，PP1c［6］，StKRBP1［21］等，這些基因在寄主中增強表達會導致寄主抗性下降。靶標蛋白對解析效應子調控寄主免疫應答機制和如何提高馬鈴薯抗性具有重要作用。但是，絕大多數RXLR效應子在寄主植物中的互作靶標仍然不清楚。系統解析晚疫病菌核心效應子如何通過操控寄主靶標蛋白抑制寄主免疫應答反應，可為將來通過在寄主中加強被效應子抑制的正調控因子，同時抑制負調控因子作用來提高馬鈴薯持久抗性提供新思路。

4.3 P. infestans中AVR蛋白與馬鈴薯Rpi蛋白間的互作機制

近年來，由于效應子組學策略的發展和應用，大大加速了P. infestans的AVR和馬鈴薯Rpi基因的克?。?8］，但是P. infestans中的AVR蛋白與馬鈴薯Rpi蛋白之間的精細互作機制報道很少。迄今為止只有兩篇相關報道，即Rpi-blb1直接互作識別AVR-blb1，Rpi-R2 間接識別 AVR2［24，43］。另外有關 RXLR效應子直接或間接抑制效應子激發免疫反應（ETI）的研究報道也不多［7，39］。因此，對已克隆的AVR和對應Rpi的互作機制還需要更深入研究。同時，如何將P. infestans與馬鈴薯互作機理的研究成果應用于P. infestans群體組成、小種變化動態監測、指導抗病品種選育，抗源合理布局及延長抗性品種使用年限等，還有待更深入系統的研究。

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